Grupo 1 - Verificação.

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1 Grupo 1 - Verificação

2 Temas a abordar: Teste de suscetibilidade aos antibióticos; Testes:
Placa de testemunho; Teste de viabilidade; Processo de transconjugação; Isolamento dos transconjugantes; Previsão dos resultados; Verificação.

3 Teste de suscetibilidade aos antibióticos
Ensaio que mede a susceptibilidade ou resistência de uma bactéria aos antibióticos Realizado em placas de agar, rico em proteínas e hidratos de carbono que fornecem o substrato ideal para o desenvolvimento e crescimento de bactérias de interesse clínico

4 Teste de suscetibilidade aos antibióticos
São utilizados discos de difusão antibióticos depositados sobre a superfície do meio onde se inoculou, por espalhamento, uma amostra de uma cultura bacteriana previamente desenvolvida em meio líquido. Tendo como base a tabela de Teste de Susceptibilidade, podemos comparar os resultados e concluir a eficácia de cada antibiótico em inibir o crescimento das bactérias

5 Teste de suscetibilidade aos antibióticos
AMC - amoxicilina + ácido clavulânico NAL - ácido nalidíxico AMX - amoxicilina AZT - aztreonam FOX - cefoxitina FEP - cefepime

6 999 – klebsiela pneumoneae
Halo com 19 mm no disco de ácido nalidíxico; sendo por isso sensível Resistente a todos os B-lactâmicos; Lac +

7 K802N - Escherichia coli Sensível a todos os B-lactâmicos;
Resistente ao ácido nalidíxico; Lac -

8 TESTE DE VIABILIDADE E TESTEMUNHO
Meio em Gelose de Ágar Não seletivo Não diferencial Meio em Gelose de Ágar Contem Amoxicilina + Ácido Nalidixico

9 TESTE DE VIABILIDADE E TESTEMUNHO
Permite verificar a viabilidade das bactérias: observa-se crescimento tanto da bactéria dadora como da recetora. Permite verificar se as bactérias são, de facto, sensíveis aos antibióticos utilizados Bactérias Vivas e Viáveis Não se verifica crescimento bacteriano

10 TESTE DE VIABILIDADE E TESTEMUNHO
OBSERVAÇÕES TESTE DE VIABILIDADE PLACA TESTEMUNHO

11 Conjugação bacteriana
Klebsiela pneumonae E. coli

12 Em que consiste: Procedimento: Resultados:
Conjugação é a transferência de DNA plasmídico de uma bactéria dadora (Klebsiela pneumoneae) para uma bactéria recetora (E. coli). Procedimento: Promoveu-se a conjugação bacteriana por dois métodos: 1. Encontro em gelose de agár; 2. Encontro em caldo. Resultados: Após incubação tanto da placa como do caldo obteve-se uma mistura bacteriana constituída por bactéria dadora, recetora e transconjugantes .

13 Isolamento dos Transconjugantes
Consiste na separação das bactérias transconjugantes das bactérias dadoras e receptoras, obtidas no final do processo de transconjugação. Este processo vai permitir avaliar o comportamento das bactérias transconjugantes, no que respeita ao seu fenótipo. Permitindo assim, compará-las com o fenótipo das bactérias que lhes deram origem.

14 Procedimento Ágar Plaqueamento Mãe
Recolha da massa de crescimento obtido Diluições 1/10 Suspensão em 1 mL de Soro Fisiológico 1/100 1/1000

15 Procedimento Caldo Diluições Mãe 1/10 10/100 1/1000 Plaqueamento

16 Meio de MacConkey + Antibióticos
Plaqueamento Meio de MacConkey + Antibióticos Macconkey Lactose Vermelho Neutro Cristal violeta Sais Biliares Utilizado para o isolamento de bactérias Gram negativo. Permite diferenciar bactérias Lac+ e Lac-

17 Meio de MacConkey + Antibióticos
Plaqueamento Meio de MacConkey + Antibióticos Antibióticos Ác. Nalidíxico Quinolona Actua inibindo as topoisomerases II e IV Impede a formação dos ácidos nucleícos Amoxicilina Oximino-ß-lactâmico Do grupo das amino-penicilinas Atua na fase parietal da formação do peptidoglicano Inibe a acção das transpeptidases

18 Previsão dos resultados
Teoricamente as placas Mac Conkey deveriam ter colónias âmbar/amarelas.

19 Previsão dos resultados
Contudo podem aparecer placas com colónias vermelhas. Cresceram colónias da bactéria dadora. Transconjugantes mudaram de cor porque houve degradação do antibiótico que produz ácidos. Sofreram alguma mutação que lhes fez ganhar a resistência ao antibiótico.

20 Verificação Para verificar se na situação anterior existem apenas colónias transconjugantes: Isolamento em meio Mac Conkey sem antibióticos Colónias Vermelhas – Bactéria dadora Colónias amarelas – Bactéria T

21 Previsão de resultados
Pode ocorrer o crescimento de colónias satélites (bactérias recetoras). Necessário verificar se as bactérias que cresceram no meio seletivo são apenas as transconjugantes

22 Verificação Podemos fazer de 3 maneiras
Inocular as bactérias obtidas em meio Mac Conkey com discos de antibiótico de amoxicilina e ácido nalidíxico. Inocular as bactérias obtidas em meio Mac Conkey com os antibióticos inseridos no agar. Estria à superfície Técnica do isolamento em quadrantes

23 Colónias que cresceram são de bactérias Transconjugantes
Verificação Inocular as bactérias obtidas em meio Mac Conkey com discos de antibiótico de amoxicilina e ácido nalidíxico. Colónias que cresceram são de bactérias Transconjugantes

24 Colónias que cresceram são de bactérias recetoras
Verificação Inocular as bactérias obtidas em meio Mac Conkey com discos de antibiótico de amoxicilina e ácido nalidíxico. Colónias que cresceram são de bactérias recetoras

25 Colónias que cresceram são de bactérias Transconjugantes
Verificação Inocular as bactérias obtidas em meio Mac Conkey com os antibióticos inseridos no agar. Estria à superfície Colónias que cresceram são de bactérias Transconjugantes

26 Colónias que cresceram são de bactérias recetoras
Verificação Inocular as bactérias obtidas em meio Mac Conkey com os antibióticos inseridos no agar. Estria à superfície Colónias que cresceram são de bactérias recetoras

27 Verificação Técnica do isolamento em quadrantes
Inocular as bactérias obtidas em meio Mac Conkey com os antibióticos inseridos no agar. No 4º quadrante teremos as bactérias Transconjugantes