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IMPLANTAÇÃO DE UMA METODOLOGIA DE ANÁLISE DE Giardia E Cryptosporidium EM UMA ESTAÇÃO DE TRATAMENTO DE ÁGUA Ivan Canale Antonio Carlos Ferreira Felipe.

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1 IMPLANTAÇÃO DE UMA METODOLOGIA DE ANÁLISE DE Giardia E Cryptosporidium EM UMA ESTAÇÃO DE TRATAMENTO DE ÁGUA Ivan Canale Antonio Carlos Ferreira Felipe Augusto Gasparotto SEMAE – Piracicaba-SP XVIII Exposição de Experiências Municipais em Saneamento De 4 a 9 de maio de Uberlândia - MG

2 Protozoários Emergentes: Giardia e Cryptosporidium Protozoários: grupo de microrganismos; vida livre ou parasitas; alguns patogênicos. Giardia spp. e Cryptosporidium spp.: protozoários patogênicos veiculados pela água contaminada. Contaminação: ingestão de água contaminada; preparo de alimentos com água contaminada; contato recreacional ou profissional. ETA de ciclo completo: processos de coagulação- floculação-decantação e filtração são as principais barreiras para remoção de cistos e oocistos de protozoários; tais organismos são resistentes à cloração realizada nas ETAs.

3 Giardia spp. – Trofozoíto (a) e cisto (b) Fonte: Karanis, 2011.

4 Giardia spp. – cisto (RID)

5 Cryptosporidium spp. - oocisto Fonte: Cantusio Neto, 2008.

6 Presença de protozoários em mananciais de abastecimento Descarga de esgotos domésticos tratados ou não tratados e o lançamento de efluentes contendo fezes de animais podem contaminar os mananciais superficiais utilizados para abastecimento público com (oo)cistos (KARANIS, 2011) ; Grau e o tipo de ocupação da bacia hidrográfica, a existência de cobertura vegetal e a pluviosidade como fatores que contribuem para a ocorrência de (oo)cistos nos mananciais (LeCHEVALLIER; NORTON; LEE, 1991; ATHERHOLT et al., 1998; KISTEMANN et al., 2002; BASTOS et al., 2004; HACHICH, et al., 2004; DIAS, et al., 2008).

7 Presença de protozoários em mananciais da região de Piracicaba Cantusio Neto (2004): Rio Atibaia – Giardia (0 a 94,5 cistos/L); ausência de Cryptosporidium. Oliveira (2005): Rio Atibaia (50 amostras analisadas) – presença de Giardia em mais de 50% das amostras analisadas; presença de Cryptosporidium em uma amostra. Monitoramento da CETESB (2001, 2002, 2003): Rio Piracicaba: grande número de resultados positivos para Giardia (0 – 153 cistos/L); em 2002, 11 coletas, 36% resultados positivos para Cryptosporidium (0,1 a 0,6 oocistos/L). CETESB: Rio Corumbataí - presença de Giardia em novembro de 2001 (0,8 cistos/L) e setembro de 2002 (6,9 cistos/L); ausência de Cryptosporidium.CETESB: Rio Corumbataí - presença de Giardia em novembro de 2001 (0,8 cistos/L) e setembro de 2002 (6,9 cistos/L); ausência de Cryptosporidium.

8 Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde e o monitoramento de protozoários Art. 31, § 1º: “quando for identificada média geométrica anual maior que 1000 Escherichia coli/100 mL, deve-se realizar monitoramento de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. no(s) ponto(s) de captação de água”. Art. 31, § 2º: “quando a média aritmética da concentração de oocistos de Cryptosporidium spp. for maior ou igual a 3,0 oocistos/L no(s) pontos(s) de captação de água, recomenda- se a obtenção de efluente em filtração rápida com valor de turbidez menor ou igual a 0,3 uT em 95% (noventa e cinco por cento) das amostras mensais ou uso de processo de desinfecção que comprovadamente alcance a mesma eficiência de remoção de oocistos de Cryptosporidium spp”.

9 Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde e o monitoramento de protozoários Art. 31º, § 4º: “a concentração média de oocistos de Cryptosporidium spp. referida no § 2º deste artigo deve ser calculada considerando um número mínimo de 24 (vinte e quatro) amostras uniformemente coletadas ao longo de um período mínimo de um ano e máximo de dois anos”. A Portaria também estabelece no seu artigo 30º, § 2º o valor máximo permitido (VMP) de 0,5 uT para a água filtrada por filtração rápida (tratamento completo ou filtração direta).

10 O objetivo deste trabalho é relatar a implantação de uma metodologia de monitoramento de Giardia e Cryptosporidium em águas brutas e tratadas pelo Serviço Municipal de Água e Esgoto de Piracicaba – SP – Brasil (SEMAE – Piracicaba), os custos envolvidos nesse processo e os resultados analíticos do monitoramento nos mananciais utilizados para abastecimento público (rios Piracicaba e Corumbataí) e nas ETAs de Piracicaba, durante o ano de Objetivos

11 Técnicas analíticas para detecção de protozoários em amostras de água ETAPAS GERAIS: Concentração da amostra de água, com a finalidade de recuperar ou capturar (oo)cistos; Purificação dos (oo)cistos, com separação dos organismos-alvo de materiais particulados e interferentes presentes na amostra; Detecção por reação de imunofluorescência, identificação e contagem em microscópio. Principais metodologias recomentadas (para concentração da amostra): Floculação com carbonato de cálcio Sistema Filta-Max® Filtração em membranas

12 Concentração por filtração em membranas (Franco, et. al., 2012) Vantagens:  aplicabilidade a amostras de água tratada ou bruta (mesmo amostras de composição físico-química complexa);  menor custo e menor tempo de processamento laboratorial;  preserva a morfologia dos (oo)cistos. Principal fator limitante: turbidez, que causa a obstrução dos poros da membrana, gerando a necessidade de trocá- la para filtrar toda a amostra.

13 Concentração por filtração em membranas (Franco, et. al., 2012) Filtração da amostra: membrana éster de celulose, 47 mm, 3 ou 1,2 µm. Água Bruta: 0,3 a 2 litros Água tratada: 15 a 20 litros Raspagem da membrana: Alça plástica estéril; 20 min.; usar solução de eluição (Tween 80 0,1%)

14 Concentração por filtração em membranas (Franco, et. al., 2012) Raspagem da membrana (final) Concentrado no tubo para centrifugação: 1050 xg durante 10 min (realizar este procedimento 2 vezes)

15 Concentração por filtração em membranas (Franco, et. al., 2012) Pellet final no eppendorf: desejável um volume final de 500µL ou menor

16 Reação de Imunofluorescência Direta (RID) Kit Merifluor para análise de Cryptosporidium e Giardia: análise de alíquotas de 10µL do pellet Microscópio de Imunofluorescência

17 Critérios de Positividade  Fluorescência verde-maçã brilhante;  Ausência de poros ou apêndices;  Tamanho e forma compatíveis: 8-18 µm de comprimento / µm de largura e formato oval para cistos de Giardia spp., e µm de diâmetro, formato esférico e presença (não obrigatória) de sutura para oocistos de Cryptosporidium spp. (CANTUSIO NETO, 2008; USEPA, 2012). Oocisto de Cryptosporidium (RID e DAPI) (USEPA, 2012) Cisto de Giardia (RID e DAPI) (USEPA, 2012)

18 Investimento (em R$) para implantação da Metodologia de Filtração em Membrana para Detecção de Giardia e Cryptosporidium em amostras de água EquipamentosCusto Estimado Sistema de Filtração: bomba de pressão positiva1.500,00 Porta filtro para membrana de 47 mm de diâmetro1.000,00 Centrífuga de mesa, rotor com swing6.200,00 Agitador de tubos Vórtex1.400,00 Microscópio de Imunofluorescência40.000,00 Reagentes Kit para reação de imunofluorescência direta (Merifluor)3.000,00 Reagentes para solução de eluição (Tween 80 e Anti-Espumante)1.000,00 Materiais Diversos Membrana de ésteres de celulose, porosidade 3 µm / 1,2 µm600,00 Placas de petri de plástico 60 x 15 (100 placas)140,00 Tubos plásticos tipo Falcon para centrífuga (15 mL) – pacote com 40 tubos50,00 Tubos eppendorf de 1 mL (pacote com 500 unidades)30,00 Pipetas automáticas e ponteiras (5-100 microlitros)900,00 Outros pequenos materiais (lamínulas, alças (loop) estéril, pipetas plásticas descartáveis, etc.) 80,00 Treinamento de um técnico em instituição especializada (IB – UNICAMP)1.000,00 Total56.900,00

19 Controle de Qualidade Analítica Experimentos Controle Positivos Experimentos Controle Negativos Porcentagem média de recuperação para métodos de análise de Giardia e Cryptosporidium estabelecidos pela USEPA (2005) Porcentagem média de recuperação (%) Desvio Padrão (%) Giardia spp Precisão e recuperação inicial (água destilada) Precisão e recuperação contínua (efeito da matriz) Cryptosporidium spp Precisão e recuperação inicial (água destilada) Precisão e recuperação contínua (efeito da matriz)

20 Resultados dos testes de precisão e recuperação em água destilada: número de cistos / oocistos inoculados, recuperados, percentual de recuperação, média e desvio padrão (DP) Nº do TesteNº de cistos inoculado Nº de cistos recuperado % de recuperação de cistos Nº de oocistos inoculado Nº de oocistos recuperado % de recuperação de oocistos , , , , , , , ,8 Média DP 41,675 27,75 Média DP 92,325 23,93

21 Resultados dos testes de precisão e recuperação em água bruta de manancial superficial: turbidez da água bruta, número de cistos / oocistos inoculados, recuperados, percentual de recuperação, média e desvio padrão (DP) Nº do Teste Turbidez (NTU) Nº de cistos inoculado Nº de cistos recuperado % de recuperação de cistos Nº de oocistos inoculado Nº de oocistos recuperado % de recuperação de oocistos 158, , ,8 2106,036000, ,8 311, , ,7 427, , ,4 Média DP 56,4 75,902 Média DP 31,4 56,851 Controle negativo (2 testes): ausência de cistos e oocistos na lâmina.

22 Monitoramento da turbidez (NTU), E. coli (NMP/100 mL) e protozoários (Giardia – nº de cistos/L e Cryptosporidium - nº de oocistos/L) na água bruta do rio Piracicaba ColetaTurbidezE. coliGiardiaCryptosporidium Janeiro / ND Fevereiro / ,6ND Março / ND Abril / ,7ND Maio / ND Junho / ,5ND Julho / ,0ND Agosto / ND Setembro / ,7ND ND: não detectado.

23 Monitoramento da turbidez (NTU), E. coli e protozoários (Giardia – nº de cistos/L e Cryptosporidium - nº de oocistos/L) na água bruta do rio Corumbataí ColetaTurbidezE. coliGiardiaCryptosporidium Janeiro / , ,0ND Fevereiro / ND Março / ,0ND Abril / ND Maio / ND Junho / ,3ND Julho / ,2 Agosto / ,8ND Setembro / ,0ND ND: não detectado.

24 Cistos de Giardia isolados em amostras do rio Corumbataí – reação de imunofluorescência direta (arquivo pessoal) A turbidez média da água filtrada foi 0,43 NTU para as amostras da ETA 1 e 0,52 NTU para as amostras da ETA 3. Não foram detectados cistos ou oocistos de protozoários nas amostras de água filtrada avaliadas em ambas as ETAs.

25 CONSIDERAÇÕES FINAIS Mananciais de abastecimento público no Brasil: poluídos por esgotos domésticos e dejetos animais; Importância do monitoramento de organismos patogênicos (Giardia e Cryptosporidium) pelas estações de tratamento de água para consumo humano (atendimento da Portaria 2914/2011); Metodologias de análises de protozoários: necessidades de investimento ($), treinamento; Técnicas analíticas: variabilidade e baixa reprodutibilidade de resultados; Turbidez da água: um dos principais fatores limitantes (inerente à amostra).

26 DÚVIDAS E ESCLARECIMENTOS ????

27 OBRIGADO!!! Contato: SEMAE – Piracicaba Setor de Controle de Qualidade Fone: (19) /

28 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APHA/AWWA/WEF. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 ed., Washington DC, APHA, CANTUSIO NETO, R.; FRANCO, R.M.B. Ocorrência de oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp. em diferentes pontos do processo de tratamento de água em Campinas, São Paulo, Brasil. Higiene Alimentar, vol. 18, n. 118, p , COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de São Paulo 2002, Série Relatórios / Secretaria de Estado do Meio Ambiente, CETESB, São Paulo, 279 p., COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de São Paulo 2001, Série Relatórios / Secretaria de Estado do Meio Ambiente, CETESB, São Paulo, 160 p., COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de São Paulo 2000, Série Relatórios - CETESB, São Paulo, 138 p., FRANCO, R.M.B.; HACHICH, E.M.; SATO, M.I.Z.; NAVEIRA, R.M.; SILVA, E.C.; CAMPOS, M.M.C.; CANTUSIO NETO, R.; CERQUEIRA, D.A.; BRANCO, N.; LEAL, D.A.G. Avaliação da performance de metodologias de detecção de Cryptosporidium spp. e Giardia spp. em água destinada ao consumo humano, para o atendimento às demandas da Vigilância em Saúde Ambiental no Brasil. Epidemiol. Serv. Saúde, Brasília, 21 (2): , abr-jun KARANIS, P. Giardia and Cryptosporidium: Occurrence in Water Supplies. In: Encyclopedia of Environmental Health, vol. 2: , Burlington, Elsevier, MINISTÉRIO DA SAÚDE - BRASIL - PORTARIA Dispõe sobre os procedimentos de controle e de vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Publicada em 12/12/2011. PADUA, V. L. (coord.) Remoção de microrganismos emergentes e microcontaminantes orgânicos no tratamento de água para consumo humano. Projeto PROSAB, ABES, Rio de Janeiro, p , UNITED STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (USEPA). Office of Water. Washington DC. Method : Cryptosporidium and Giardia in Water by filtration/IMS/FA. EPA-816-R , January, 2012.


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