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Introdução a Biologia Molecular Profª Daniela de Oliveira Pinto.

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Apresentação em tema: "Introdução a Biologia Molecular Profª Daniela de Oliveira Pinto."— Transcrição da apresentação:

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2 Introdução a Biologia Molecular Profª Daniela de Oliveira Pinto

3 ORGANISMO CÉLULA NÚCLEO CROMOSSOMOS (DNA+PROTEÍNAS) - Informação das proteínas e RNAs que serão sintetizadas pelas células do organismo ao longo da sua vida. -Capacidade de se auto- duplicar para originar outras células. DNA NOS SERES HUMANOS

4 1953: Watson and Crick Estrutura do DNA

5 Dogma Central da Biologia Molecular

6 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON mRNA é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma

7 1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA Seqüências sucessivas de três nucleotídeos do DNA (codon) determinam a seqüência de aminoácidos de uma proteína O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!!

8 DNA 1. Regulação transcricional HnRNA 2. Regulação no processamento do RNA primário 3. Regulação no transporte do mRNA para o citoplasma RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO RUGOSO 4. Regulação da síntese proteíca Proteína sintetizada 5. Regulação pós-síntese A CÉLULA - DIFERENCIAÇÃO - CRESCIMENTO - FUNÇÃO CELULAR - RESPOSTA AO AMBIENTE

9 DNA Cromossoma Gene Promotor Intron Exon Núcleo

10 DNA

11 ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA) Contém toda a informação genética de um organismo Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes

12 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatro diferentes nucleotídeos: Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA e RNA Timina – encontrada somente no DNA Uracila – encontrada somente no RNA

13 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS Todos os nucleotídeos apresentam uma estrutura em comum: radical fosfato pentose

14 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS As bases nitrogenadas podem ser divididas em dois grupos de acordo com sua estrutura:

15 ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS O grupo hidroxil ligado ao carbono 3 da pentose de um nucleotídeo forma uma ligação fosfodiéster com o fosfato do outro nucleotídeo 5 C-A-G 3

16 DNA Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estrutura de dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fita e as bases projetam-se para o interior da mesma As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes de hidrogênio entre as bases o que contribui para a estabilidade da dupla hélice. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes de hidrogênio. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes de hidrogênio

17 DNA

18 As fitas do DNA estão dispostas em direções opostas Antiparalelismo

19 Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita Complementariedade

20 Durante a replicação do DNA as duas fitas velhas ou mães servem de molde para cada fita nova ou filha complementar, que está sendo sintetizada. Fita nova Fita velha Complementariedade

21 Fatores que estabilizam a dupla hélice: interações hidrofóbicas forças de van der Walls pontes de hidrogênio interações iônicas Entre as bases nitrogenadas Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg 2+ ) presentes na solução fisiológica A Dupla Hélice

22 Sulco menor Sulco maior A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos quais se ligam as proteínas da cromatina A Dupla Hélice

23 Proteínas:níveis de complexidade estrutural

24 O Empacotamento do DNA: a estrutura terciária do DNA DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-super- helicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)

25 A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário A Dupla Hélice

26 Propriedades Químicas e Físicas do DNA

27 REPLICAÇÃO DO DNA Conservativa ou Semiconservativa? Unidirecional ou Bidirecional?

28 REPLICAÇÃO SEMICONSERVATIVA Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958 Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio para crescimento contendo sais de amônia preparados com 15 N (nitrogênio pesado – heavy) até todo o DNA celular conter o isótopo. As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14 N (nitrogênio leve – light). As amostras foram analisadas com gradiente de densidade que separa as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.

29 PNAS 44:671, 1958

30 The Meselson-Stahl experiment A replicação é semi-conservativa

31 ORIGEM DA REPLICAÇÃO Experimento com SV40 (Simian Virus) DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com a enzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único. A partir de um ponto vai se formando uma bolha chamada bolha de replicação comprovando a existência de um ponto de origem da replicação Características da origem de replicação:. estrutura repetitiva. seqüências ricas em AT

32 ORIGEM DA REPLICAÇÃO ORIGEM Sítio de restrição EcoRI Cromossomo viral circular EcoRI Bolha de replicação

33 ORIGEM DA REPLICAÇÃO

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35 REPLICAÇÃO BIDIRECIONAL Um experimento através da autoradiografia de moléculas de DNA marcadas de culturas de células mamárias revelou grupos de replicons (unidades de replicação) com um ponto de origem de replicação central OR

36 Síntese de DNA em Eucariontes : As Bolhas de Replicação Nos eucariontes, a replicação requer múltiplas origens, devido ao tamanho de seu genoma. A replicação é bidirecional e, em ambas as fitas, simultânea. Este processo gera bolhas de replicação.

37 Região Gênica É a porção que codifica para um produto final, que pode ser uma cadeia polipeptídica ou um RNA O DNA é formado por 2 regiões: GênicasIntergênicas Região Intergênica É a porção regulatória, que sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a transcrição gênica, ou que é o ponto de início para a replicação do DNA IntergênicasGênicas Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA

38 PROCESSO DE REPLICAÇÃO Os mecanismos celulares responsáveis pela replicação do DNA foram descobertos primeiramente em bactérias. A replicação em eucariotos ocorre através de proteínas análogas e com processos semelhantes à replicação do DNA de E. coli

39 PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA) 1.DNA Polimerases 2.Endonucleases 3.Helicases 4.Topoisomerases 5.Primases 6.Telomerases

40 DNA POLIMERASE São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênio que ligam as duas fitas do DNA Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente Catalisam a adição de um nucleotídeo no radical hidroxil da extremidade 3 da cadeia que está se formando. Desta forma, as fitas só podem crescer no sentido 5 3

41 DNA Polimerases principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início – alongamento 3 tipos principais : I, II, III I : importante no sistema de reparo III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)

42 Adição de nucleotídeos 1 2 3

43 NUCLEASES - Degradam o DNA, clivando-o em pedaços menores 1.EXONUCLEASES: clivam o DNA a partir do final da molécula 2.ENDONUCLEASES: clivam em qualquer local da molécula

44 OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se mover ao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula. SSB (single-strand-binding) – ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas. PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNA utilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA. TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita que não está sendo replicada.

45 PROCESSO DE REPLICAÇÃO O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3 5 e outra no sentido oposto 5 3 Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos FITA LEADING – crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação FITA LAGGING – crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação

46 PROCESSO DE REPLICAÇÃO FITA LEADING – sintetizada continuadamente a partir de um iniciador na fita molde 3 5 FITA LAGGING – sintetizada descontinuadamente a partir de múltiplos iniciadores Sítios descobertos no molde da fita lagging são copiados em pequenos iniciadores de RNA pela primase. Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando na formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI. DNA polimerase remove o primer do RNA do fragmento adjacente e preenche os gaps entre os fragmentos que, então, são unidos pela DNA ligase.

47 PROCESSO DE REPLICAÇÃO

48 A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua

49 TELOMERASE Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentam seqüências repetitivas em suas extremidades denominadas telômeros A síntese da fita leading continua até o término da fita molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita pela primase na fita lagging não é digerida. Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo. Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.

50 TELOMERASE

51 REGULAÇÃO -única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ; -afetada pela metilação de DNA -DAM metilase na (5´) GATC sobre a fita parental

52 Gene RNA polimerase hnRNA mRNA Citoplasma Transcrição Processamento Núcleo Tradução proteína

53 O RNA ou ARN O açúcar é uma Ribose; É formado, geralmente, por uma fita simples que pode enrolar-se; Não existe a base pirimídica Timina e no seu lugar se encontra a base Uracila. Os pareamentos seguem a ordem A-U e G-C). O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do DNA em três aspectos básicos: A-U U-A G-C C-G A-T T-A G-C C-G DN A RN A

54 RNA - É o ácido ribonucléico; possui a função de síntese protéica. O RNA é encontrado no núcleo principalmente no nucléolo, e no citoplasma (ribossomos). Composição química - é formada por ácido fosfórico, pentose (ribose) e pelas bases nitrogenadas ( A, G, C e uracila (U )). A molécula de DNA é responsável pela formação do RNA. O RNA apresenta-se constituído por um único filamento de nucleotídeo, cuja seqüência de bases é determinada a partir de um molde de DNA.

55 1-RNA mensageiro (RNAm) - É formando no núcleo tendo como molde uma das fitas de uma molécula de DNA. A produção de um RNAm, cujas bases são complementares as bases de uma das hélices de uma molécula de DNA, recebe o nome de transcrição. Este fenômeno pode ser definido de forma mais simples como sendo a passagem das bases de uma linguagem do DNA para a linguagem de RNAm. EX: T - A - C - T - G - A - DNA 3 bases correspondem a um aa, e um ! ! ! ! ! ! conjunto de bases uma proteína. A - U - G A - U - G - A - C - U RNAm Códon início códon proteína aa A aa B Tipos de RNA

56 Síntese Protéica A enzima RNA-polimerase abre a dupla hélice do DNA e inicia a produção de uma molécula de RNAm, no sentido 5 3. Os nucleotídeos são ligados respeitando a ordem A-U, G-C. Ao final da transcrição a RNA- polimerase se desliga do DNA, a molécula de RNAm está formada e segue para o citoplasma onde será traduzida. A Transcrição

57 Observe a complementação de uma fita de DNA para RNA A T A C A T G G G C T A G A A UUUUUUGGCCCCAAA Sempre com a adenina se ligando a uracila e a guanina se ligando a citosina. DNA RNA RNAm

58 2-RNA transportador (RNAt) - é produzido nos cromossomos a partir de DNA especiais. É uma molécula cadeia curta, (é o menor RNA) que transporta os aa que estão dispersos no citoplasma até os ribossomos. O RNAt tem formato de folhas de trevo e contém outros tipos de bases, além das comumente encontradas nos outros RNAs. Cada RNAt é capaz de reconhecer um determinado aa determinado códon, no RNAm. Todo RNAt tem um filamento livre de sua molécula composta pela seguinte seqüência de bases: ACC. É nesse local que ocorre a associação com o aa. Em cada região da molécula existe uma seqüência de 3 bases denominadas anticódon, que reconhece a posição do aa no RNAm.

59 Tipos RNAs (2/2)

60 RNA TRANSPORTADOR

61 3-RNA ribossômico (RNAr) é o RNA que ocorre em maior quantidade nas células. Esse RNA é encontrado no nucléolo, onde é produzido, e no citoplasma, associado às proteínas, formando os ribossomos.

62 Tipos de RNA RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e contém a mensagem - o código transcrito a partir do DNA - para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON. RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e é responsável pelo transporte dos aminoácidos até os ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon chamada de ANTI-CÓDON. RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da estrutura dos ribossomos e participa do processo de tradução dos códons para construção das proteínas.

63 SÍNTESE DE PROTEÍNAS: A síntese começa quando ocorre a transcrição das bases de DNA para RNA. Essa transcrição é o código genético. O RNAm formado no núcleo passa para o citoplasma, deslocando-se para os ribossomos. Os RNAt que estão no citoplasma, através de suas moléculas, unem-se ao aa livre levando até o ribossomo. Lá o anticódon do RNAt reconhece no códon do RNAm o aa, que será codificado. Assim, ocorrendo sucessivamente, até dar origem a uma proteína. Núcleo DNA RNAm RNAm Transcrição Proteínas Tradução Núcleo DNA-RNAm A síntese completa de uma proteína leva de 20 a 60 seg, e o mesmo RNAm pode ser traduzido por vários ribossomos, que mantêm uma Distância entre si de aproximadamente 80 nucleotídeos.

64 Os Íntrons e os Éxons Nos eucariontes, o RNA transcrito pelo gene é normalmente chamado de pré- RNA, no sentido de que ele ainda não está pronto para ser traduzido, produzindo proteínas. O pré-RNA seria, assim uma versão ainda não acabada do RNAm, que precisa ser primeiro processado no núcleo para, em seguida, migrar ao citoplasma. A Éxon Íntron Éxon Íntron Os Íntrons são retirados e os éxons são soldados um ao outro

65 Síntese Protéica O RNAm transcrito no núcleo chega ao citoplasma e se liga a um ou mais ribossomos. O ribossomo lê o primeiro códon e um RNAt com o anticódon correspondente transporta um aminoácido e se liga ao códon. O ribossomo se desloca, no sentido 5 3 e lê o próximo códon. Os aminoácidos são unidos por ligações peptídicas. Ao final da tradução o polipeptídeo se desliga e se constituí na proteína. A Tradução

66 O ribossomo acomoda dois tRNAs carregados

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68 4. Terminação

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70 Dogma Central da Biologia Molecular Foi estabelecido em 1956 por Francis Crick. Postulava que o sentido da construção das moléculas é sempre de DNA à Proteína – fluxo unidirecional da informação. O DNA é o molde para formar DNA (replicação) e RNA (transcrição). Este por sua vez é o molde para formação das proteínas (tradução). Hoje se sabe que, em alguns vírus, o RNA pode replicar-se e, em outros, o RNA pode produzir DNA (transcrição reversa) utilizando o maquinário genético da célula-hospedeira. Porém, não é possível se sintetizar ácidos nucléicos a partir de proteínas. Os novos conhecimentos permitiram que se ampliasse o dogma central sem contudo perder a unidirecionalidade, ou seja, de ácido nucléico à proteína. Projeto Proteômico.

71 Diferenças entre RNA e DNA O RNA é uma molécula intermediária na síntese de proteínas, ela faz a intermediação entre o DNA e as proteínas. Ele é formado por uma cadeia de ribonucleotídeos, que, por sua vez, são formados por um grupo fosfato, um açucar (ribose), e uma base nitrogenada (veja abaixo). As principais diferenças entre o RNA e o DNA são sutis, mas fazem com que o último seja mais estável do que o primeiro. O RNA é formado por uma fita simples, o açúcar de seu esqueleto é a ribose e uma de suas bases pirimídicas (de anel simples) é diferente da do DNA (uracila ao invés de timina), além disso o açucar do RNA é a ribose invés da desoxirribose do DNA. DNA RNA

72 Os processos de síntese de proteínas na célula são controlados pelo metabolismo de controle.As duas principais personagens do metabolismo de controle são as moléculas de DNA e RNA. O DNA (ácido desoxirribonucléico) é o patrimônio genético, que contém as instruções para a síntese de todas as proteínas que a célula é capaz de realizar. O RNA atua como mensageiro (RNA mensageiro) entre o DNA e o ribossomo, local de síntese de proteínas. DNA (ácido desoxirribonucléico)RNA (ácido ribonucléico) Se localiza somente no núcleoSe localiza no núcleo e no citoplasma Apresenta forma de dupla hélice com duas fitas Apresenta apenas uma fita É formado com a pentose (açúcar) desoxirribose É formado com a pentose ribose Bases nitrogenadas participantes: A, T, C, G Bases nitrogenadas participantes: A, U, C, G DNA e RNA

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75 Código Genético Codon que dá origem à síntese de qualquer proteína Código Genético – correspondência entre cada tripleto (codon) de RNA e cada um dos 20 aminoácidos habituais das proteínas (desde 1964) No código genético há 64 trincas possíveis, apenas 61 delas correspondem a aminoácidos. As tres trincas restantes são usadas como pontuação; elas dizem à célula o ponto em que termina a codificação de cada proteína. Genoma Conjunto de moléculas de DNA

76 Oração do DNA Creio no DNA todo poderoso criador de todos os seres vivos, creio no RNA, seu único filho, que foi concebido por ordem a graça do DNA polimerase. Nasceu como transcrito primário padeceu sobre o poder das nucleases, metilases e poliadenilases. Foi processa, modificado e transportado. Desceu do citoplasma e em poucos segundos foi traduzido à proteína. Subiu pelo retículo endoplasmático e o complexo de Golgi E está ancorado à direita de uma proteína G Na membrana plasmática De onde há de vir a controlar a transdução de sinais Em células normais e apoptóticas Creio na Biologia Molecular Na terapia gênica e na biotecnologia No seqüenciamento do genoma humano Na correção de mutações Na clonagem da Dolly Na vida eterna. Amém


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