血红蛋白作为催化剂 高灵敏测定过氧化氢 报告人 : 刘立宇. 本文采用血红蛋白作为过氧化物酶 的替代物，用于催化 H 2 O 2 氧化对甲 基酚的反应体系。从而建立了高灵敏 测定痕量 H 2 O 2 的荧光分析法。

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1 血红蛋白作为催化剂 高灵敏测定过氧化氢 报告人 : 刘立宇

2 本文采用血红蛋白作为过氧化物酶 的替代物，用于催化 H 2 O 2 氧化对甲 基酚的反应体系。从而建立了高灵敏 测定痕量 H 2 O 2 的荧光分析法。

3 引言 痕量 H 2 O 2 的测定不论是在临床生 物化学还是在环境化学中都有重要 意义。酶法测定 H 2 O 2 一般是基于 过氧化物酶催化 H 2 O 2 氧化底物的 反应来实现的。

4 ◊ 本文用 Hb 作为催化剂催化 H 2 O 2 氧化对甲基酚的反应，建立了测定 H 2 O 2 的高灵敏荧光分析方法。

5 实验部分 ➮ 仪 仪器与试剂 ➮ 实 实验方法

6  仪器 RF-5301PC 荧光仪； SFM-25 荧光 仪 ； PH-3C 数字型精密酸度计； GS501 超级 恒温槽。  试剂 血红蛋白生化试剂，配成 1×10 -5 mol/L 的水溶液；对 - 甲酚 (99%) 移取 105.6μL, 用 二次蒸馏水稀释至 100mL ，得 1×10 -2 mol/L 的储 备液； H 2 O 2 ：移取 0.1mL30% 的分析纯过氧化 氢稀释至 100 mL ，得 1.064×10 -2 mol/L 的储备 液 ，棕色瓶装 ，冰箱保存，使用时依实验需 要进行稀释 。所用其他试剂除注明外 ，均为 分析试剂，所用水为二次蒸馏水。

7 ⇩ 在 10 mL 比色管中依次加入系列 H 2 O 2 溶液； 1×10 -3 mol/L 对甲基酚 1.0 mL ； pH=10.3 的 NH 3 -NH 4 Cl 缓冲溶液 3.0 mL ； 1×10 -5 mol/L 血 红蛋白 0.50 mL 。用二次水定容，混合均匀 后，室温放置 10min ，测定产物在激发波长 318nm ，发射波长 427nm 处的荧光强度。 ☆

8 结果与讨论 ➭ 体系的荧光光谱 ➭ 血红蛋白的催化活性比较 ➭ 过氧化氢测定条件的选择 ➭ 分析方法特性 ➭ 干扰情况 ➭ 样品测定

9 体系的荧光光谱 ⇨用⇨用血红蛋白催化对甲基酚与 H 2 O 2 的反应得到的 荧光产物为 2,2’ - 二羟基 – 4 ， 4’- 二甲基联苯， 其荧光的激发和发射光谱如图 1 （ a ），最大激发 和发射波长为 λ ex / λ em =318nm/427nm 。 ⇨需⇨需要指出的是，血红蛋白在本实验条件下亦产 生微弱的荧光，这是由于其分子中肽链上的色 氨酸和酪氨酸所致。然而其最大激发和发射波 长为 λ ex / λ em =318nm/427nm （如图 1 b ）对本体 系只产生微弱的本底值 。

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12 血红蛋白的催化活性比较 血红蛋白的催化活性比较 ◇基于血红蛋白的上述结构特点，我们研究 了对甲基酚浓度对血红蛋白催化反应速率 的影响情况。实验结果显示，当对甲基酚 浓度较低时，其与反应速率成正比，表现 为一级反应。随着对甲基酚浓度的增高， 表现为混合级反应。当对甲基酚浓度大于 3×10 -4 mol/L 时，反应速率不再上升，此时 反应速率与对甲基酚浓度无关，表现为零 级反应。

13 血红蛋白的催化活性比较 血红蛋白的催化活性比较 ◇利用 Linewear-Burk 图，由截距和斜率求得 V m = 1.6 min -1 ， K m = 8.75×10 -4 mol/L ，再 由方程： V m = K cat [ E 0 ] 求得酶催化的转换 数 K cat = 6.4×10 6 L/ mol·min 。

14 血红蛋白的催化活性比较 血红蛋白的催化活性比较 ◇按同样方法实验测得了氯化血红素和合成 的环糊精 - 氯化血红素（ β-CD-Hemin ）等过 氧化物模拟酶的 K m 、 V m 和 K cat 值 ( 表 1) 。 比较发现，这 3 种铁卟啉化合物对底物对甲 基酚的催化氧化活性顺序为 ： Hb ＞ β-CD-Hemin ＞ Hemin

15 过氧化氢测定条件的选择 ⇘酸⇘酸度及氨浓度 ⇘对⇘对甲基酚浓度 ⇘血⇘血红蛋白（ Hb ）的浓度

16 酸度及氨浓度 酸度是酶催化反应需要用缓冲溶液严格控制 的条件之一。我们比较了 NH 3 -NH 4 Cl 、甘氨 酸 -NaOH 、硼砂 -NaOH 、 NaHCO 3 及混合酸 - NaOH 等缓冲体系。发现在 NH 3 -NH 4 Cl 缓冲 溶液中，当 pH 10.3 时产物的荧光强度最大。 同时我们固定这一酸度实验了 NH 3 浓度对体 系荧光强度的影响情况，结果显示的最佳 氨浓度是 0.03mol/L 。表明血红蛋白的催化 活性也可被氮配体（如 NH 3 ）所增强。

17 对甲基酚浓度 对甲基酚作为酶催化反应的氢供体，浓度 太低，将使反应不完全而导致信号太弱； 浓度太高，亦可使信号损失，并且造成浪 费和环境污染。为此，本实验选择的对甲 基酚浓度为 1×10 -4 mol/L 。

18 血红蛋白（ Hb ）的浓度 由于血红蛋白是一荧光物质 ，尽管在本实 验选定的条件下荧光强度很弱，然而当其 浓度太大时，会导致较大的空白值，并且 造成浪费。当浓度很低时，在测定时间内 催化反应不完全。实验结果表明：当血红 蛋白浓度在 2×10 -7 ～ 6×10 -7 mol/L 时，体系 荧光强度最大且恒定 。 本实验选择 5×10 - 7 mol/L 为最佳用量。

19 分析方法特性 按选择的实验条件测定了 H 2 O 2 ； 在 3.19×10 -8 ～ 3.19×10 -6 mol/L 范围内，线性 方程为 F =26.83 + 28.59[ H 2 O 2 ]×10 7 mol/L,(r = 0.9990) ，相对标准偏差（以 5.32×10 - 7 mol/L 为样品 11 次测定结果） RSD = 2.1% 。 检出限按空白标准偏差（ n = 9 ）的 3 倍除以 校准曲线的斜率，得 8.85×10 -10 mol/L 。

20 干扰情况 以 1.1×10 -6 mol/L H 2 O 2 的测定考察了不同干扰离子 的影响，当要求相对误 ≤5 ％，外加离子的允许量 （摩尔比）为： F － 、 SCN － 、 NO 3 － 、 Br － 、 PO 4 3 － 、 CO 3 2 － 、 Ba 2+ 、 Mo （ V ）、 Cr 3+ （ 1000 倍）； Al 3+ 、 Mg 2 ＋ 、 Sn( Ⅳ ) （ 500 倍）， Hg 2+ 、 Ni 2+ 、 NO 2 － （ 200 倍）， Ag + 、 Cu 2+ （ 100 倍）， D- 葡萄 糖、 Fe 3+ （ 20 倍）、 Zn 2 ＋ （ 100 倍），尿酸、 Co 2+ （ 5 倍）， Mn 2+ （ 1 倍）。

21 样品测定 收集不同地方的雨水，直接测定，结果见表 2 。 血红蛋白具有价廉易得、贮存方便、实验条件温 和等优点，相信其过氧化物酶的特性会在临床及 生命相关物质的测定中起到重要的作用，并会得 到广泛的应用。

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23 谢谢！