Fosforilação oxidativa mitocondrial

Relações energéticas entre anabolismo e catabolismo Macromoléculas celulares Proteínas Polissacarídeos Lipídeos Ácidos nucléicos Moléculas precursoras Aminoácidos Açúcares Ácidos graxos Bases nitrogenadas ADP + HPO42- NAD+ NADP+ FAD ATP NADH NADPH FADH2 Catabolismo Nutrientes contendo energia Açúcares Lipídeos Proteínas Produtos finais pobres em energia CO2 , H2O, NH3

Energia livre associada à hidrólise do ATP

Variação da energia livre de Gibbs para a hidrólise do ATP ATP  ADP + Pi G’(kJ mol-1) [ATP/ADP] 10-7 (equilíbrio) -11,4 10-5 -22,8 10-3 -28, 10-2 -34,2 10-1 -45,6 10 (citosol em condição celulares) -57,0 103 pH 7; [Mg2+]=10-2 e [Pi]= 10-2M

Mecanismo de fosforilação do ADP na fermentação láctica: acoplamento de reações Glicose  2lactato + H+ G’= -196 kJ mol-1 de glicose

EVOLUÇÃO DA VIDA NA TERRA 2H2O + luz + clorofila O2 + 2H++ 2 e- + 4e- H2S + luz + bacterioclorofila S + 2H++ 2 e- CO2+4H2CH4 +2H2O

E X R C Í I O 1

NÚMERO DE OXIDAÇÀO DO CARBONO EM VÁRIOS GRUPOS FUNCIONAIS

Energia produzida a partir da oxidação completa de vários compostos orgânicos a dióxido de carbono e água Variação de entalpia medida em um calorímetro (calor liberado) Substância Energia produzida kJ mol-1 kJ g-1 kcal g-1 kcal g-1 peso fresco Glicose 2.817 15,6 3,7 - Lactato 1.364 14,2 3,6 Ácido palmítico 10.040 39,2 9,4 Glicina 979 13,1 3,1 Carboidratos 16 3,8 1,5 Gorduras 37 8,8 Proteínas 17 4,1

Estágio 1 Produção de Acetil-CoA Catabolismo de proteínas lipídeos e carboidratos Estágio 2 Oxidação de Acetil-CoA Estágio 3 Transporte de elétrons e fosforilação oxidativa

REAÇÕES BIOLÓGICAS DE ÓXIDO REDUÇÃO Glicose  2lactato + H+ G’= -196 kJ mol-1 de glicose Glicose + 6O2  6CO2 + 6 H2O G = -2840 kJ mol-1 Fe2+ + Cu2+  Fe3+ + Cu+ Elétrons transferidos diretamente como elétrons AH2 + B  A + BH2 2. Elétrons transferidos como átomos de hidrogênio (H) ou hidreto (H-) R-CH3 + ½ O2  R-CH2-OH 3. Elétrons transferidos através de combinação direta com oxigênio molecular Equivalentes de redução: elétron independente da forma de transferência

POTENCIAL DE ÓXIDO-REDUÇÃO É UMA MEDIDA DA AFINIDADE POR ELÉTRONS Dois pares redox A tendência da direção da reação depende da afinidade relativa de cada par redox por elétrons Esta afinidade pode ser medida experimentalmente em Volts tendo como referência a afinidade do par H+/1/2H2 O potencial redox padrão do par H+/1/2H2 em condições padrões é tomado como zero (V) e simbolizado por E’ ox + ne-  red

MEDIDA DO POTENCIAL DE ÓXIDO-REDUÇÃO

O potencial de óxido redução padrão (E’) pode Reação de óxido redução envolve 2 pares redox O potencial de óxido redução padrão (E’) pode ser usado para calcular a variação de energia livre padrão da reação (G’) Acetaldeído + NADH + H+  Etanol + NAD+ Acetaldeído + 2H+ + 2e-  Etanol E’h’=-0,197V NAD+ + 2H+ + 2e-  NADH + H+ E’h =-0,320 V G’°=-2 x 96,9kJ/V mol x 0,123 V= -23,7 kJ mol-1

A variação de energia livre de uma reação de óxido-redução (G) depende da concentração dos pares redox Se acetaldeído e NADH estiverem presentes a uma Concentração de 1,0 M e etanol e NAD+ a 0,1 M

EXERCÍCIOS: CÁLCULO DE G DE REAÇÕES DE ÓXIDO REDUÇÃO Considerando a seguintes reação: Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ E tendo os seguintes valores de E’ : 1. NAD+/NADH = -0,32 V 2. Piruvato/lactato = -0,19 V Responda: a) Qual par conjugado tem maior tendência em doar elétrons? b) Qual é o agente oxidante mais forte? c) Quando todos os reagentes estiverem na concentração de 1M a pH 7,0, em qual direção a reação deve ocorrer? d) Qual é o G’° da reação para a conversão de piruvato a lactato? e) A reação contrária poderá ocorrer na célula?

Citosol Mitocôndria

CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO Ciclo do Ácido cítrico Acetil-CoA Ciclo do Ácido cítrico

ESTRUTURA DA FLAVINA ADENINA DINUCLEOTÍDEO (FAD) FAD forma oxidada FAD forma reduzida

ESTRUTURA DA NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTÍDEO (NAD+ / NADH)

Estágio 1 Produção de Acetil-CoA Catabolismo de proteínas lipídeos e carboidratos Estágio 2 Oxidação de Acetil-CoA Estágio 3 Transporte de elétrons e fosforilação oxidativa

FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA DO ADP 2H+ 4H+ 4H+ ½ O2 H2O Succinato Fumarato NADH NAD+

FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA DO ADP 2H+ 2H+ 4H+ 4H+ 4H+ 4H+ H+ H+ + + + + + + + + + + + + + + H+ H+ H+ _ _ _ _ + + _ _ _ _ _ _ _ H+ ½ O2 ½ O2 H2O H2O Fumarato Fumarato Succinato Succinato ADP + Pi NADH NADH H+ NAD+ NAD+ 3H+ ATP _ _ Potencial químico pH ( alcalino interior) Síntese de ATP dirigida pela força próton- motriz Potencial elétrico  ( negativo interior) _ _

Separação dos complexos funcionais da cadeia respiratória NADH Q Suc Q Q Cit c Cit c O2 ATP ADP+Pi I II III IV V Separação dos complexos funcionais da cadeia respiratória Transpor- tadores de elétrons funcionam em complexos multi- enzimáticos

CADEIA DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS Complexo I NADH desidrogenase FMN Fe-S Acil-CoA desidrogenase Flavoproteína FAD, Fe-S ½ O2 H2O Complexo IV Citocromo aa3 2 cit-a Ions Cu Complexo III Complexo bc1 2 cit-b Fe-S Rieske Cit-c (c1) UQ/UQH2 Cit c Complexo II Succinato desidrogenase FAD Fe-S Cit-b Sn-glicerofosfato desidrogenase FAD, Fe-S

Complexos protéicos da cadeia de transporte de elétrons Massa (kDa) Número de subunidades Grupos prostéticos I NADH desidrogenase 850 42 (14) FMN, Fe-S II Succinato desidrogenase 140 5 FAD, Fe-S III Ubiquinona:citocromo c oxidoredutase 250 11 Hemes, Fe-S Citocromo c 13 1 Heme IV Citocromo oxidase 160 13 (3-4) Hemes, CuA, CuB

Estados de oxidação da FMN e da CoQ A + 2e- + 2H+ <-> AH2

ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS FERRO-ENXOFRE Fe+3 + 1e- <-> Fe2+

CITOCROMOS Fe+3 + 1e- <-> Fe2+ Estrutura secundária do citocromo b bH bL Matriz mitocondrial Citocromo c Fe+3 + 1e- <-> Fe2+

REAÇÕES DE ÓXIDO REDUÇÃO: POTENCIAL REDOX

Potencial redox padrão de transportadores de elétrons da cadeia respiratória mitocondrial Reação redox (semi-reação) E’(V) C O M P L E X I NAD+ + 1H+ + 2e-  NADH -0,36 NADH desidrogenase (FMN) + 2H+ + 2e-  FMNH2 -0,30 Fe/S-N2(Fe+3) + e-  Fe/S-N2(Fe+2) -0,02 [FAD] + 2H+ + 2e-  [FADH2] ligado na enzima 0,048 Ubiquinona (UQ) + 2H+ + 2e-  Ubiquinol(UQH2) Ubiquinona (UQ) + H+ + e-  Semiquinol(UQH) 0,045 0,03 Citocromo b (Fe3+) + e-  Citocromo b (Fe2+) 0,077 Fe/S-Rieske (Fe+3) + e-  Fe/S-Rieske (Fe+2) 0,28 Citocromo c1 (Fe3+) + e-  Citocromo c1 (Fe2+) 0,22 Citocromo c (Fe3+) + e-  Citocromo c (Fe2+) 0,254 Citocromo a (Fe3+) + e-  Citocromo a (Fe2+) 0,29 Citocromo a3 (Fe3+) + e-  Citocromo a3 (Fe2+) 0,55 ½ O2 + 2H+ + 2e- H2O 0,816 C O M P L E X III C O M P L E X IV

FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA DO ADP 2H+ 2H+ 4H+ 4H+ 4H+ 4H+ H+ H+ + + + + + + + + + + + + + + H+ H+ H+ _ _ _ _ + + _ _ _ _ _ _ _ H+ ½ O2 ½ O2 H2O H2O Fumarato Fumarato Succinato Succinato ADP + Pi NADH NADH H+ NAD+ NAD+ 3H+ ATP _ _ Potencial químico pH ( alcalino interior) Síntese de ATP dirigida pela força próton- motriz Potencial elétrico  ( negativo interior) _ _

POTENCIAL DE ÓXIDO-REDUÇÃO ox + ne-  red ox + ne- + mH+  red Reação de óxido redução envolve 2 pares redox Relação entre G e E Para a reação: NADH + H+ +1/2 O2  H2O + NAD+ NADH + 2e-  NAD+ Eh =-0,315V ½ O2 + 2H+ + 2e-  H2O Eh =+0,815V G°=-2 x 96,9 x 1,13 = -218 kJ mol-1

NADH  NAD+ (-0,315V)   CoQ (+0,045V)     Citocromo c (+0,235V) -0,4 NADH  NAD+ (-0,315V)  ComplexoI Eº’ = 0,360V Gº’ = -69,5 kJ mol-1 -0,2 E’ (V) (+0,030V)  Succinato FADH2 ComplexoII  CoQ (+0,045V)   Fumarato ComplexoIII Eº’ = 0,190V Gº’ = -36,7 kJ mol-1 0,2  0,4 Citocromo c (+0,235V)  ComplexoIV Eº’ = 0,580V Gº’ = -112 kJ mol-1 0,6  2H++ ½ O2  H2O (+0,815V) 0,8

Meio sem aeração contendo mitocôndrias + ADP + Pi e succinato sem O2 EVIDÊNCIAS EXPERIMENTAIS DA TEORIA QUIMIOSMÓTICA O2 é injetado a 1 min Meio sem aeração contendo mitocôndrias + ADP + Pi e succinato sem O2

EVIDÊNCIAS EXPERIMENTAIS DA TEORIA QUIMIOSMÓTICA Meio sem aeração contendo mitocôndrias + ADP + Pi e succinato sem O2 O2 é injetado a 1 min

FOSFORILAÇÃO OXIDATIVA DO ADP 2H+ 2H+ 4H+ 4H+ 4H+ 4H+ H+ H+ + + + + + + + + + + + + + + H+ H+ H+ _ _ _ _ + + _ _ _ _ _ _ _ H+ ½ O2 ½ O2 H2O H2O Fumarato Fumarato Succinato Succinato ADP + Pi NADH NADH H+ NAD+ NAD+ 3H+ ATP _ _ Potencial químico pH ( alcalino interior) Síntese de ATP dirigida pela força próton- motriz Potencial elétrico  ( negativo interior) _ _

Geração do gradiente de prótons (Teoria quimiosmótica, proposto por Peter Mitchell, Nobel de 1978) Modelo de loop redox

Estequiometria de cargas e prótons na cadeia respiratória modelo loop redox X proton pump 2H 2e- NADH 2H+ III + UQ ½O2+2H+ H2O Loop redox c NADHO2 : 6H+ I III IV ½O2+2H+ NADH H2O UQ 4H+ 2H+ 2e- Proton pump c NADHO2 : 8 a 10H+ I III IV

Mecanismo de translocação de prótons no Complexo III: Ciclo Q

Ciclo Q

Energética da transferência de prótons através da membrana: definição da força próton-motriz X Gradiente de concentração X X+ - + Gradiente elétrico transmembrana X X+ - + Gradiente de concentração e gradiente elétrico transmembrana G = gradiente eletroquímico iônico =  x+ No caso da mitocôndria: X+=H+ e –log[H+] = pH, então Mitchell definiu o termo força próton-motriz (p) Um gradiente eletroquímico de H+ de 1 kJ mol-1, corresponde a uma força próton-motriz de 10,4 mV.

Estágio 1 Produção de Acetil-CoA Catabolismo de proteínas lipídeos e carboidratos Estágio 2 Oxidação de Acetil-CoA Estágio 3 Transporte de elétrons e fosforilação oxidativa

BETA-OXIDAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS

MODELO QUIMIOSMÓTICO PARA SÍNTESE DE ATP 2H+ 2H+ 4H+ 4H+ 4H+ 4H+ H+ H+ + + + + + + + + + + + + + + H+ H+ H+ _ _ _ _ + + _ _ _ _ _ _ _ H+ ½ O2 ½ O2 H2O H2O Fumarato Fumarato Succinato Succinato ADP + Pi NADH NADH H+ NAD+ NAD+ 3H+ ATP _ _ Potencial químico pH ( alcalino interior) Síntese de ATP dirigida pela força próton- motriz Potencial elétrico  ( negativo interior) _ _

CICLO DO ÁCIDO CÍTRICO Ciclo do Ácido cítrico Acetil-CoA Ciclo do Ácido cítrico

CADEIA DE TRANSPORTE DE ELÉTRONS Complexo I NADH desidrogenase FMN Fe-S Acil-CoA desidrogenase Flavoproteína FAD, Fe-S ½ O2 H2O Complexo IV Citocromo aa3 2 cit-a Ions Cu Complexo III Complexo bc1 2 cit-b Fe-S Rieske Cit-c (c1) UQ/UQH2 Cit c Complexo II Succinato desidrogenase FAD Fe-S Cit-b Sn-glicerofosfato desidrogenase FAD, Fe-S

Componentes do complexo F1Fo-ATP sintase

As três subunidades da ATPsintase podem assumir três diferentes conformações Estrutura do complexo F1 deduzida por cristalografia e estudos bioquímicos

O movimento de prótons pela membrana impulsiona a rotação do anel Semi- canal de H+ (cit) H+ (mit) O canal é fromado por  10 subunidades c 360 = uma rotação completa 3H+ leva a rotação de  120  em  levando a liberação de um ATP do complexo, ou seja: 3H+ devem retornar para a matriz para cada ATP formado

Transferência de ATP, ADP e fosfato entre a mitocôndria e o citosol

MODELO QUIMIOSMÓTICO PARA SÍNTESE DE ATP 2H+ 2H+ 4H+ 4H+ 4H+ 4H+ H+ H+ + + + + + + + + + + + + + + H+ H+ H+ _ _ _ _ + + _ _ _ _ _ _ _ H+ ½ O2 ½ O2 H2O H2O Fumarato Fumarato Succinato Succinato ADP + Pi NADH NADH H+ NAD+ NAD+ 3H+ ATP _ _ Potencial químico pH ( alcalino interior) Síntese de ATP dirigida pela força próton- motriz Potencial elétrico  ( negativo interior) _ _

Adenina nucleotídeo translocase e fosfato translocase ATP/ADP = ATP/ADP =

Regulação integrada da produção de ATP

Transferência de equivalentes redutores do citosol para a matriz mitocondrial: lançadeiras

Lançadeira malato-aspartato Fígado, rim e coração

Lançadeira glicerol 3-fosfato Músculo esquelético e cérebro

NADH citosólico

Matriz mitocondrial Acetil-CoA

BETA-OXIDAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS

Regulação integrada da produção de ATP

Estequiometria da síntese de ATP Adenina nucleotídeo e Pi translocase: 1H+ ADP + Pi + 3H+p  ATP + H2O + 3H+n NADH O2 = 10H+/2e-  10H+/4H+ = 2,5 ATP Succinato (FADH2) O2 = 6H+/2e-  6H+/4H+ = 1,5 ATP Produção de ATP na oxidação completa de glicose Processo Produto ATP final Glicólise 2 NADH (citosólico) 3 ou 5 2 ATP 2 Oxidação do piruvato (2 por glicose) 2 NADH (mitocondrial) 5 Oxidação de acetil-CoA no ciclo de Krebs 6 NADH (mitocondrial) 15 (2 por glicose) 2 FADH2 3 2 ATP ou GTP Produção total por glicose 30 ou 32