BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOS São Paulo 2005 Projeto de Tese apresentado à Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências

1. Introdução 1.1 - Contexto Bywaters, 1941 Haimovici, 1960  Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares traumáticas Haimovici, 1960  Síndrome metabólica pós-revascularização Haimovici, 1973  Síndrome mionefropática ou de reperfusão Burihan, 1982  O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na síndrome Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1:427-32. Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: 739-47. Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): 439-44. Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79.

1.1- Contexto Myers, 1986 Joves, 1982 Ward, 1988  Injúria renal decorre da magnitude e da duração da isquemia Joves, 1982  A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução tubular e necrose tubular aguda Ward, 1988  Pouco progresso no tratamento a despeito do conhecimento Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97. Joves DB. Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254. Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148: 1553-7.

1.1- Contexto Granger, 1988 Vargas, 1995 Kelly, 1996  Radicais livres de oxigênio e lesão celular Vargas, 1995  Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal reperfundido em ratos Kelly, 1996  Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM1) Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225:1269-75. Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7. Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:1056-63.

1.1- Contexto Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1) Vargas, 1995  Bloqueio de substâncias quimioatrativas Linderman, 1998  Diminuição da adesividade leucocitária Gupta, 1998  Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1  Diminuição da resistência vascular periférica Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6):713-7. Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15. Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7.

1.2- Hipótese O uso do alprostadil, por via intravenosa, atenua o efeito das lesões metabólicas e histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

1.3- Objetivo Avaliar os efeitos da infusão intravenosa do alprostadil num modelo experimental de isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

2. Métodos 2.1-Tipo de estudo Projeto aprovado pelo comitê de ética da UNCISAL, protocolo 16-A, em13/10/2004. 2.1-Tipo de estudo - Ensaio clínico aleatório em animais de experimentação 2.2-Local 2.2.1-Laboratório do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória - FMSP-BA

2. Métodos 2.3 –Amostra 2.3.1 – Amostragem Ratos machos Linhagem OUT B Wistar Idade - 90 a 120 dias Peso - 250 a 350 g 15 dias - observação e adaptação Condições controladas 2.3.1 – Amostragem Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória da FMSP-BA

2. Métodos 2.4.1 - Randomização - Sorteio aleatório - Examinadores 2.4 Procedimentos 2.4.1 - Randomização - Envelopes - Sorteio aleatório - Examinadores

2. Métodos 2.4 Procedimentos 2.4.2 - Grupos experimentais Grupo Sh (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento. Grupo Ct ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão. Grupo Al ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão.

2.4 Procedimentos 2.4.3 Modelo experimental Pré operatório Foram submetidos a jejum (6h) Foram devidamente pesados Submetidos a sorteio Anestesia Fenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitoneal Sono profundo Estímulos dolorosos irresponsivos Doses complementares de anestésico

2.4- Procedimentos 2.4.3- Modelo Experimental Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa Tricotomia ventral abdominal com lâmina de barbear Incisão abdominal mediana Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do segmento abdominal até acima das artérias renais Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al) Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al) No Grupo Sh não há isquemia e reperfusão

2.4- Procedimentos 2.4.3- Modelo Experimental Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Alprostadil (Grupo Al), antes da reperfusão Amostras de sangue Nefrectomia esquerda e preparo das peças Eutanásia – dose anestésica letal

2.4 Procedimentos

2.4 Procedimentos 2.4.3 Modelo experimental Estudo histológico (microscopia ótica) Hematoxilina eosina Ácido Periódico de Schiff (PAS) Azul patente (Azul de Alcion) Estudo Imunohistoquímico (Laboratório de biologia molecular da Fiocruz-Salvador) Amostras de Tecido Renal

2.5.1- Variáveis primárias 2.5.1.1- Estudo imunohistoquímico Dosagem de Molécula de adesão intercelular do tipo 1 (ICAM-1) Análise qualitativa de desarranjo estrutural

2.5.1- Variáveis primárias Tecido renal sem isquemia Tecido renal com isquemia e reperfusão

2.4 Procedimentos Grau I Grau II

2.4 Procedimentos Grau IV Grau III

2.5.1- Variáveis primárias 2.5.1.2- Estudo histológico Jablonski, 1983 Grau 0: Normal Grau 1: Mitoses e necrose de células individualmente Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos contorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveis Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo contorcido proximal. Desarranjo estrutural moderado Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo contorcido proximal com desarranjo estrutural severo intersticial

2.5.1 Variáveis primárias 2.5.1.2 Estudo histológico

2.5.1 Variáveis primárias 2.5.1.2 Estudo histológico Grau I Grau II

2.5.1 Variáveis primárias 2.5.1.2 Estudo histológico Grau IV Grau III

2.5.2 Variáveis secundárias 2.5.2.1- Avaliação bioquímica sérica Desidrogenase lática  Leucometria Creatina-fosfoquinase  Potássio Lactato  Hemogasimetria Uréia Sódio Creatinina Cálcio

2.6- Modelo Estatístico 2.6.1- Cálculo do tamanho da amostra 2.6.2- Análise estatística Análise de variância por postos de Kruskal Wallis Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentes P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de nulidade

3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias Gráfico 1. Distribuição dos graus de necrose entre os grupos

3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias Gráfico 2. Análise Imunohistoquímica entre os grupos

3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias Gráfico 3. Comparativo da análise histológica entre os grupos

3. Resultados 3.1 Caracterização da amostra □ Grupo Sh □ Grupo Ct □ Grupo Al Gráfico 4. Médias do pesos dos ratos dos três grupos de tratamento.

3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias Comparacao dos niveis de eletrodos Gráfico 5. Comparação dos níveis de eletrólitos dos três grupos de tratamento.

3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias ■ Grupo Al Gráfico 6. Comparação de LDH e CPK dos três grupos de tratamento.

3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias Controle SF0,9% Alprostadil Gráfico 7. Comparação da Gasometria (pO2 e pCO2) dos três grupos de tratamento.

3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias ■ Alprostadil Gráfico 8. Comparação de Lactato e Uréia dos três grupos de tratamento.

4. Conclusões O Alprostadil, na dose de 20 microgramas/kg, atenua as repercussões imunohistoquímicas e histológicas em tecido renal de ratos submetidos a um modelo experimental de isquemia e reperfusão com clampeamento aórtico supra-renal Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na dose de 20 microgramas/kg, não foi capaz de modificar as alterações metabólicas pelos parâmetros utilizados neste estudo