Regulação da secreção gonadotrófica Prof. Nelly Pitteloud Universidade de Lausanne By Durval Damiani

Visão geral Controle da secreção gonadotrófica por GnRH Função do gonadotrofo Controle da secreção de gonadotrofinas por esteroides sexuais e inibina B

Visão geral do eixo reprodutor Múltiplos níveis de regulação Hipotálamo – programas precisos de pulsatilidade de GnRH, “inputs” múltiplos e complexos Hipófise – regulação diferencial da síntese e secreção de LH e FSH Gônada – regulação sexo-específica da esteroidogênese e gametogênese Regulação autócrina, parácrina e endócrina (alças de feed back)

Regulação da secreção gonadotrófica por GnRH

Estreita relação entre a liberação de GnRH e a secreção de gonadotrofinas (evidências na síndrome de Kallmann) História (1943) Boa saúde geral Genitais pequenos – ausência de puberdade Anosmia Exame físico Baixa estatura Envergadura > altura Ausência de pelos axilares ou pubianos Microfalus Testículos pequenos ou não palpáveis

Reproductive function: mode in the 1960’s Pituitary LH FSH LH FSH LH FSH Gonads Gonadotropins normal Hyper ↑ Hyper  Gonadal Fxn normal 1º failure 2º failure

Hypothalamic GnRH Deficiency? Kalmann Syndrome: Hypothalamic GnRH Deficiency? Normal GnRH Deficient GnRH Hypothalamus Pituitary Pulsatile GnRH Rx LH FSH LH FSH Gonads

Re-Constitutes Normal Pulsatile GnRH Rx: Re-Constitutes Normal HPG Axis in IHH Normal Adult Male T= 17nmol/L 30 LH (IU/L) 20 10 4 6 12 15 20 24 IHH Male: Baseline T= 1.2nmol/L 30 LH (IU/L) 20 10 Normal range for Healthy adult men 4 6 12 15 20 24 Gn RH IV q 2hr (ng/kg) T= 12nmol/L 80 75 2.5 7.5 25 250 60 LH (IU/L) 40 20 2 4 6 8 10 Crowley et al . J Clin Endocrinol Metab, 1980 Hofman et al. New Eng J Med. 1980

Pulsatile GnRH stimulates gonadotropin secretion Continuous GnRH downregulates gonadotropin secretion Pulsatile GnRH Continuous GnRH Pulsatile 199 GnRH 200 20 150 15 FSH (mU/L) LH (mUg/L) 100 10 50 5 10 5 5 10 15 20 25 30 35 Days Belchets PE, et al. Science 1978

Hypothalamic (GnRH) , Pituitary (LH, FSH, free  -subunit), Gonadal (Steroid) Hormone Secretory Dynamics T ½ 2-4 min GnRH GnRH FAS 15 min LH 20-40 min FSH 3 h LH FSH LH FSH P E2 2-3h P<E2<T T Estradiol Progesterone Testosterone

Variation in GnRH Pulse Pattern Results in Divergent LH and FSH Secretion GnRH avtivates gene expression for gonadotropin subunits  and , dimerization , and glycosylation LH/FSH Pulse frequency has differential modulation Faster GnRH pulses FAVOR LH synthesis & release Slower GnRH pulses FAVOR FSH synthesis & release Finkelstein et al. J Clin Invest, 1988

Ciclo menstrual : Dinâmica hipofisária,ovariana, uterina Follicular Phase Luteal Phase FSH LH primary antral dominant ovulation Corpus luteum Corpus albicans Ovarian follicles E2 Prog Endo Proliferative Secretory

Secreção de GnRH/LH durante o ciclo menstrual Mid-cycle Surge Early/Mid/Late Follicular Phase Early/Mid/Late Luteal Phase 200 LFP ELP 40 40 MFP MLP 40 40 LH EFP LLP E2 P4 40 FSH 40 MENSES Hall et al, J Endocrinol Invest, 1998

GnRH Pulse Frequency Pulsatile GnRH RX Changing the GnRH pulse frequency recapitulates normal menstrual cycles in HH women 90’ 60’ 120’ 150 LH (U/L) 100 50 30 FSH (U/L) 20 10 Idiopatic HH 600 E2 (pg/ml) 400 Acquired HH 200 Hypothalamic Amenorrhea 30 Normal range (Mean ± SD, n=24 healthy women) PROG (ng/ml) 20 10 -20 -15 -10 -5 5 10 15 20 Days from ovulation

A frequência de pulso é crítica para a secreção diferencial de LH e FSH (evidência de pacientes com SOP) Causa mais comum de infertilidade em mulheres em idade reprodutiva (8% da população) Diagnóstico segundo o workshop de Roterdam (2003) (2 de 3) Hiperandrogenismo clínico ou bioquímico Ciclos menstruais irregulares ou anovulação Morfologia de ovários policísticos Ausência de outras causas de hiperandrogenismo

Fisiopatologia dos ovários policísticos Anomalias Neuroendócrinas Anormalidades androgênicas Anormalidades da insulina

GnRH Pulse Frequency is critical for differential FSH and LH secretion Evidence from patients with Polycystic Ovarian Syndrome Hypothalamus Normal GnRH Pituitary LH FSH Cholesterol LH Ovaries Pregnenolone Progesterone FSH Granulosa Theca cell cell aromatase Estrone Androstenedione Testosterone Estradiol

GnRH Pulse Frequency is critical for differential FSH and LH secretion Evidence from patients with Polycystic Ovarian Syndrome Hypothalamus GnRH frequency LH Pituitary PCOS FSH Cholesterol Ovaries Insulin Pregnenolone Progesterone Granulosa Theca 17-OH Progesterone cell cell aromatase Androstenedione Estrone Testosterone Estradiol

A frequência de pulso é crítica para a secreção diferencial de LH e FSH (evidência de pacientes com Amenorreia Hipotalâmica) Amenorreia secundária Causa frequente de infertilidade feminina LH e FSH baixos a despeito de hipoestrogenemia História de exercícios extenuantes, distúrbios alimentares e/ou psicológicos

Fisiopatologia da amenorreia hipotalâmica funcional Stress Weight loss GnRH Extensive physical Exercise LH FSH

Variable GnRH/LH Secretion Patterns in Women with Hypothalamic Amenorrhea (n=12) Healthy Controls (n=22) Apulsatile (n=2) Amplitude (n=1) 20 20 20 15 15 15 LH (IU/mL) 10 10 10 5 5 5 4 8 12 16 20 24 4 8 12 16 20 24 4 8 12 16 20 24 Time (h)  Frequency (n=1) Nocturnal Pulses (n=8) 20 20 LH Pulse 15 15 Nighttime LH (IU/mL) 10 10 5 5 4 8 12 16 20 24 4 8 12 16 20 24 Time (h) Time (h)

Hypothalamic Amenorrhea Functional GnRH deficiency Stress,  energy availability Genetic susceptibility? Normal GnRH/LH GnRH Deficiency

Suscetibilidade genética em pacientes com amenorreia hipotalâmica Frequency of loss-of-function Mutation in the study participants, According to group. Mutation In vitro functionality Patients with Hypothalamic Amenorrhea (N=55) idiopathic Hypogonadotropic Hypogonadism (N=160) Controls who were Menstruating but not exercising (N=375) Controls who were menstruating and exercising >5 Hr/Wk (N=47) FGFR1 R756H Decreased 1 G260E PROKR2 R85H L173R 5 GNRHR R262Q 2 3 KAL1 V371l Not Assessed Caronia LM et al. NEJM, 2011

Resumo Concentrações oscilantes de LH e de FSH estão sob controle do GnRH hipotalâmico pulsátil Variações no padrão de pulso do GnRH associam-se a secreções divergentes de LH e de FSH Alterações na regulação gonadotrófica normal pelo GnRH associam-se a vários distúrbios clínicos

Os gonadotrofos hipofisários 7-15% das células da adenohipófise Grânulos mono e bi-hormonais As gonadotrofinas são compostas por 2 sub unidades α (homóloga) β (distinta para cada gonadotrofina) A sub-unidade β confere atividade hormonal específica para o heterodímero

Human Gonadotrophs Anti LH Anti FSH

GHRH1 (crom 8p11.2-p21) GnRHR (crom 4q21.2) 741bp 109bp 844bp 44bp 161bp 158bp 60bp GHRH1 (crom 8p11.2-p21) Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 1 Exon 2 Exon 3 5’-UTR 522bp 220bp 245bp 3’-UTR ~4.2 kb ~5 kb GnRHR (crom 4q21.2) TM1 TM2 TM3 TM4 TM5 TM6 TM7 Human type I GnRH Receptor cDNA 1 328 Cheng & Leung, 2005

Structure of the human GnRH receptor Millar et al, Endocr Rev, 2004

Signaling cascades downtream of the human GnRH receptor Naor Z, Front Neuroendocrinol, 2009

Conn et al, 2010

HH patient with a GnRHR mutation fails to respond to pulsatile GnRH 200 75 ng/kg 150 LH (IU/L) 100 50 30 IHH Female: Homozygous Ser217Arg FSH (IU/L) 20 10 400 300 E2 (pg/ml) 200 100 30 20 Prog (ng/ml) 10 -20 -15 -10 -5 5 10 15

Uso de “chaperones” farmacológicos para resgatar GnRHR incorretamente dobrado Conn et al, 2010

Doenças conformacionais: distúrbios associados ao dobramento alterado da proteína Doença ou anomalia GPCR Retinite pigmentosa Diabetes insipidus nefrogênico Hipogonadismo hipogonadotrófico Hipercalcemia hipocalciúrica familial Pseudo hermafroditismo masculino Disgenesia ovariana Hipotireoidismo congênito Cabelo vermelho e pele clara (propensão a câncer de pele) Deficiência familial de glicocorticoides Obesidade Ressitência a infecção pelo HIV-1 Rodopsina V2R GnRH R CaR LHR FSHR TSHR E-BR MC1R MC2R MC3R, MC4R CCR5

Resumo: GnRH liga-se ao receptor GnRHR na superfície celular dos gonadotrofos e tem o potencial de estimular diversas cascatas de sinalização Mutações do GnRHR afetando “trafficking” são a base de muitas doenças Chaperones farmacológicos são um tratamento potencial para distúrbios do “trafficking” Síntese diferencial do genes da sub-unidade β das gonadotrofinas está associado a modificações de ativação / estabilidade de importantes proteínas regulatórias e fatores de transcrição

Regulação da secreção gonadotrófica por esteroides sexuais e inibina B

Regulação gonadotrófica no homem: Esteroides sexuais vs Inibina B GnRH ? HIPOTÁLAMO ? T ? HIPÓFISE - Inh B ? LH FSH E2 TESTÍCULOS

Objetivos Caracterizar o componente de hormônios sexuais no feed back de gonadotrofinas em termos de: Sítio de ação Papeis relativos de T & E2 Determinar a contribição relativa dos esteroides sexuais vs inibina B para a regulação da secreção de FSH

Study Protocol (2) +T +E2 Relative roles of T & E2 Normal Men 25-45y Ketoconazole 400mg QID x 7d Dexamethasone 0.5mg BID +T +E2 T-, E2- T+, E2- T-, E2+ Relative roles of T & E2

LH Response to sex steroid Ablation & Physiologic Replacement 40 n=9 n=6 n=4 * * 30 * * LH (IU/L) 20 10 BL D3 D6 BL D3 D6 BL D3 D6 Ketoconazole RX Both T& E2 Normalize LH levels

LH Pulse Frequency Post Sex Steroid Ablation & Physiologic Replacement 14 n=9 NS n=6 n=4 * * * 12 * P=0.05 10 8 # Pulse / 12h 6 4 2 BL D3 D6 BL D3 D6 BL D3 D6 Ketoconazole RX Both T& E2 Slow GnRH Pulse Frequency

LH Pulse Amplitude Post Sex Steroid Ablation & Physiologic Replacement 16 n=9 n=6 * n=4 14 12 10 LH amp (IU/L) 8 6 4 2 BL D3 D6 BL D3 D6 BL D3 D6 Ketoconazole RX E2 addback has no effect on LH Amplitude

FSH Response to Sex Steroid Ablation & Physiologic Replacement * n=4 16 NS * * * 12 * FSH (IU/L) 8 4 BL D3 D6 BL D3 D6 BL D3 D6 Ketoconazole RX E2, but not T, Normalizes FSH Levels

Study Protocol (3) Role of Inhibin B Normal Men 25-45y ( n=9) Agonadal Men 23-47y (n=3) Ketoconazole Dexamethasone Off androgens X 8 weeks T-, E2-, IB+ T-, E2-, IB+- Role of Inhibin B

Inhibin B is the major regulator of FSH Secretion in the Male * 80 P<0.005 60 FSH (IU/L) 40 * Upper limit of normal 20 T + - - E2 + - - IB + + -

Sex Steroids Regulation of LH secretion in the Male GnRH - HYPOTHALAMUS ? T - E2 PITUITARY LH FSH Inh B - E2 - E2 - TESTES

Grazie per avermi regalato una giornata meravigliosa...