A Nanotecnologia ao serviço da Regeneração de Tecidos Ana Paula Pêgo Laboratório Associado IBMC-INEB Instituto de Engenharia Biomédica (INEB) NEWTherapies Group - Biomaterials Division apego@ineb.up.pt Encontro Ciência em Portugal – Ciência 2008, 2- 4 de Julho, 2008

Engenharia de tecidos Estrutura de suporte cultivada com células ou incubada em factores de crescimento O material é lentamente infiltrado pelo novo osso O tecido acaba por regenerar, corrigindo o defeito Estímulos mecânicos Factores de crescimento Nutrientes Novo osso cresce para preencher um espaço entre dois segmentos ósseos! Mooney & Mikos. Sci Am, 1999

Nanotecnologia? Porquê? 0,000000002 m 2 x 10-9 m 12.742.000 m 0.13 x 109 m

Biomimetismo 10-4 Cabelo 10-5 glóbulos vermelhos 10-6 Bactéria 10-7 Vírus 10-8 ADN 10-9 proteínas, etc 10-10 nano abacus Amaral, I. et al. 2008

Sistemas injectáveis para a regeneração óssea Another example of injectable systems under development TE strategy to deliver bone cells The whole idea is to immobilize cells whithin a biodegrad polym microsphere While polym degrades, cells multiply and synthesize ECM Eventually the polym disapears from site, leaving new tissue Polímero Célula Matriz extracelular

Rowley et al, Biomaterials (1999) Alginato Rowley et al, Biomaterials (1999) The alginate modification consisted in three different processes: the irradiation, the oxidation and the RGD coupling to the polymer chains. The irradiation will decrease the molecular weight of alginate molecule, which willlead to a decrease in the viscosity of the solution. This will be an advantage in the cell/polymer mixing step. If the polymer has a high viscosity the cells will be exposed to high shear forces which could lead to a decrease in cell viability. After, the alginate was oxidized to increase the biodegradability. Oxidation of alginate to cleave the carbon-carbon bond of the cis-diol within ssacharide rings also decreased the total Mw of alginates in proportion to the molar ratio between NaIO4 added to the reaction and the number of alginate residues in the solution. Oxidized low Mw MVG k(degradadtion constant rate) = 18x10-3/h high Mw MVG k=5x10-3/h NOTE (alsberg, 2003) 5Mrads - it provides ultimate clearence by kidneys. Irradiates alginate at or below 50kDa. http://www.steve.gb.com/science/extracellular_matrix.html

Actividade metabólica e organização do citoesqueleto Alginato-RGD Alginato células MC3T3 Dia 8 MTT coloração Dia 28 Elevada actividade metabólica Faloidina (F-actina) Iodeto de propídeo (DNA) CLSM Evangelista, M. et al, Biomaterials (2007)

Neuropatias periféricas Problemas associados a nervos do sistema periférico. Causas: Diabetes HIV Alcolismo Lesões físicas ou químicas Fracturas ósseas Tumores … entre outras

Terapia genética e regeneração nervosa Entrada nuclear Escape do endosoma Transporte retrogado Endocitose específica ADN Sobrevivência celular Produção de factores neurotróficos

Terapia genética e regeneração nervosa Entrada nuclear Escape do endosoma Transporte retrogado Endocitose específica ADN Sobrevivência celular Produção de factores neurotróficos Nanopartícula com ligandos

A estratégia Pêgo AP et al. 2008

24 h 2 3 1 2 2 Pires, L. et al. 2008 Vermelho – CHimi-ROX Rosa – ADN-Cy5 Azul – DAPI Verde – F-Actina 24 h 2 3 1 2 1- membrana celular 2- dentro do citoplasma 3- dentro do núcleo 2 Pires, L. et al. 2008

Tet toxin fragment – 5kDa PEG Complexos ADN-Quitosano + SH Poliplexo Complexo ternário + SH - - + SH SH SH + Quitosano ADN Tet toxin fragment – 5kDa PEG MAL Endocitose específica Transporte ao longo do neurónio Fuga do endossoma Sobrevivência celular Oliveira, H. et al. 2008

Especificidade e transfecção % de poliplexos 72 h % de células transfectadas Quantidade de ligando

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