Reconhecimento de Genes Marcílio C. P. de Souto DIMAp/UFRN

Aprendizado de Máquina: Aprendizado de Máquina: gera descrições próprias dos conceitos genéticos Aprendizado de Máquina: Aprendizado de Máquina: gera descrições próprias dos conceitos genéticos Reconhecimento de genes (1/2) Análise em laboratório: Análise em laboratório: difícil e cara Alternativa: uso de técnicas computacionais Variação, complexidade e natureza ainda desconhecida dos genes Dificuldade de codificar algoritmos específicos

Reconhecimento de genes (2/2) Abordagens para localização de genes: Busca por sinal: localiza indiretamente, por sinais associados à expressão gênica Promotores Sítios de início de tradução Busca por conteúdo: identifica segmentos do DNA com propriedades (padrões) de regiões codificadoras

Busca por Sinal (1/4) Localiza sinais associados à presença de genes Mais próximo do modo biológico Muitos sinais realizam funções regulatórias Ex.: velocidade de Expressão

Busca por Sinal (2/4) Alternativas: Achar seqüência consenso Muito simples Matriz de Posições Ponderadas Modelo para o sinal Dependência estatística entre nucleotídeos vizinhos Classificação Aprendizado de Máquina

Busca por Sinal (3/4) Classificação: dada janela de tamanho fixo, determinar se há sinal em uma posição particular... A T C C T T A C G C G T A... Classificador Sinal na posição 3? Posição 1 = C Posição 2 = T Posição 3 = T Posição 4 = A Posição 5 = C Posição 6 = G janela... A T C C T T A C G C G T A... Tamanho da janela Instâncias alinhadas

Busca por Sinal (4/4) Problemas: Identificação de sítios de início de tradução Identificação de promotores Identificação de sítios de splicing

Busca por Sinal – Splicing (1/8) Identificação de sítios de splicing Dado: conjunto de seqüências de DNA de tamanho fixo Faça: gerar classificador para identificar se uma janela possui uma fronteira intron-exon, exon-intron, ou nenhuma delas

Busca por Sinal – Splicing (2/8) Eucariotos Nomenclatura bordas: Exon/intron: doadoras (GT) Intron/exon: receptoras (AG) Importância: necessário demarcar precisamente segmentos de DNA traduzidos

Busca por Sinal – Splicing (3/8) Lapedes et al. (1989): ADs, RNs e kNN Janelas: 11, 21 e 41 Positivo Entrada: Entrada: Cadeia de nucleotídeos Posição 8 = ? Posição 3 = ? Negativo Posição 9 = ? A C GT A C GT A C GT Negativo PositivoNegativoPositivoNegativo Regiões Doadoras

Busca por Sinal – Splicing (4/8) Lapedes et al. (1989) Instâncias alinhadas segundo AG/GT Inclusive negativas RNs melhor: 91% precisão receptoras e 95% doadoras ADs: regras interpretáveis biologicamente

Busca por Sinal – Splicing (5/8) Para RNs (e também SVMs): necessária conversão dos nucleotídeos para valores numéricos Converter cada símbolo para valores entre 0 e 1 A = 0, B = 0.33, C = 0.66 e T = 1.0 Favorece algumas substituições de bases Algumas bases podem ser interpretadas como mais próximas Não é biologicamente comprovado Não é claro Codificação ortogonal A = 0001, C = 0010, G = 0100 e T = 1000 Considera distâncias entre bases iguais Abordagem empregada usualmente

Busca por Sinal – Splicing (6/8) Rampone (1998): abordagem híbrida envolvendo o uso de regras e de uma RN Algoritmo BRAIN (Batch Relevance-based Artificial INtelligence) Infere fórmulas Booleanas dos exemplos (regras disjuntivas) Regras são refinadas por uma RN Combinadas com um procedimento discriminante estatístico

Busca por Sinal – Splicing (7/8) Comparou seus resultados aos do projeto StatLog RN do tipo RBF (Radial Basis Function) Classificador Bayesiano RN do tipo MLP Algoritmo C4.5, indutor de ADs Algoritmo k-NN Verificou de forma geral maior acurácia dos modelos baseados em RNs Rampone (1998)

Busca por Sinal – Splicing (8/8) Lorena et al. (2002): SVMs e ADs Melhores resultados obtidos pelas SVMs (95% confidência) Pré-processamento visando eliminar ruídos Levou a simplificações nos modelos induzidos SVMs: em alguns casos houve também melhora de desempenho ADs: diminuições no tamanho das árvores induzidas  ganhos em termos de compreensibilidade

Busca por Sinal – SITs (1/6) Identificação de sítios de início de tradução Dado: conjunto de seqüências de DNA (ou mRNA) de tamanho fixo Faça: gerar classificador para identificar sítios de início de tradução (SITs) em uma janela

Busca por Sinal – SITs (2/6) Tradução não se inicia com primeira tripla de nucleotídeos do mRNA Geralmente códon AUG (metionina) Shine–Dalgarno Procariotos: precedendo códon inicial  seqüências Shine–Dalgarno Stormo et al. (1982): RN Perceptron (SITs de E. coli) Gerar MPP

Busca por Sinal – SITs (3/6) A CG T A CG T A CG T... A T C G T G C T T A C G C G C G T C C A... Janelas: 51, 71, 101 (melhor) Codificação canônica Stormo et al. (1982)...

Busca por Sinal - SITs (4/6) MPP obtida foi mais precisa que diversos métodos de consenso Pesos mais significativos corresponderam àqueles conectados ao SIT e à região Shine-Dalgarno Deficiência: Perceptron  padrões linearmente separáveis Futschik et al. (1999): redes multicamadas Stormo et al. (1982)

Busca por Sinal – SITs (5/6) Zien et al. (2000): SVMs no reconhecimento de SITs de vertebrados Desempenho comparado ao de RNs e a um método Markoviano Janelas de mRNA de 200 nucleotídeos Codificação canônica (cinco bits)

Busca por Sinal – SITs (6/6) Desempenho melhor das SVMs Informações a priori Privilegiar correlações locais entre nucleotídeos Melhorou resultados Reformulação da função Kernel considerando informações providas pela técnica estatística Melhores resultados na aplicação Zien et al. (2000)

Busca por Sinal – Promotores (1/8) Identificação de promotores Dado: conjunto de seqüências de DNA de tamanho fixo Faça: gerar classificador para identificar promoto- res em uma janela

Busca por Sinal – Promotores (2/8) Transcrição se inicia com RNA polimerase se ligando ao promotor Towell et al. (1990): KBANN  RNAs + regras simbólicas em promotores de E. coli TTGACA TAATTATAC RNAm RNA polimerase Promotor procarioto gene

Busca por Sinal – Promotores (3/8) Regras proposicionais para inicializar topologia e pesos de uma RN Identificavam TATAbox, TTGACA e regiões controversas Regras falharam no reconhecimento de instâncias com promotores Janela: 57 nucleotídeos Promotor alinhado sete nucleotídeos à direita da janela Codificação canônica (quatro bits) Towell et al. (1990)

Busca por Sinal – Promotores (4/8) Redução no tempo de treinamento das RNs Melhora na generalização das redes RNs aprenderam a descartar as regras que correspondiam a regiões controversas Indicação que não correspondiam a características relevantes Towell et al. (1990)

Busca por Sinal – Promotores (5/8) Resultados obtidos foram comparados Rede MLP AD induzida pelo algoritmo ID3 Algoritmo k-vizinhos mais próximos Técnica referenciada na literatura biológica RNs se sobressaíram em relação à técnica biológica Eficácia de técnicas de AM Algoritmos k-NN e ID3 foram inferiores  pode ser conseqüência da dificuldade em lidar com muitos atributos Towell et al. (1990)

Busca por Sinal – Promotores (6/8) Reese e Eeckman (1995): combinação de RNs no reconhecimento de promotores vertebrados Identificação de promotores eucariotos pode ser considerada mais custosa e complexa Promotor eucarioto URS UAS TATA IRN ATG - + Holoenzima Pol II RNAm gene

Busca por Sinal – Promotores (7/8) RNs individuais para a identificação de duas regiões TATA-box Cadeia denominada Iniciadora (IRN) RNs foram treinadas com um procedimento de poda de conexões Na combinação das RNs  rede do tipo Time Delay Neural Network (TDNN) Reese e Eeckman. (1995)

Busca por Sinal – Promotores (8/8) Janela de 51 nucleotídeos Resultados das TDNNs foram comparados aos das RNs individuais RNs se mostraram pouco acuradas individualmente Combinação pela TDNNs gerou ganhos significativos Acurácia Redução da taxa de falsos positivos Reese e Eeckman. (1995)

Busca por Conteúdo (1/3) Reconhece genes por padrões gerais que ocorrem em regiões codificadoras Objetivo: identificar regiões traduzidas em proteínas (janela fixa) Procariotos: distinguir genes das regiões não-codificadoras entre eles Eucariotos: também distinguir introns de exons

Busca por Conteúdo (2/3) Questões: Que regiões são codificadoras Qual fase de leitura codifica proteína  Open Reading Frame (ORF) Como agrupar nucleotídeos consecutivos em triplas... A T G C C T A A T... Met.Pro. Asp.... A T G C C T A A T... Cis. Leu.... A T G C C T A A T... Ala. Parada

Busca por Conteúdo (3/3) Propriedades que podem ser exploradas: Alguns aminoácidos são mais usados Preferência de códon de um organismo Alguns aminoácidos têm maior ‘afinidade’

Regiões codificadoras (1/8) Identificação de regiões codificadoras Dado: conjunto de seqüências de DNA de tama- nho fixo Faça: gerar classificador para identificar se uma janela é codificadora ou não Se for codificadora, identificar sua ORF

Regiões codificadoras (2/8) Farber et al. (1992): Perceptron com ativação Sigmoidal para distinguir introns de exons 64 entradas: freqüência de cada codon Janelas de 5 a 90 codons Maiores levaram em geral a melhores predições 4096 entradas: freqüência de cada dicodon Melhores resultados

Regiões codificadoras (3/8) Resultados comparados a um classificador Bayesiano baseado em preferências de códons Maior precisão das RNs Resultado atribuído ao fato do classificador Bayesiano assumir independência entre códons vizinhos Farber et al. (1992)

Regiões codificadoras (4/8) Representação por dicódons melhorou a generalização Desempenho com o uso da representação de apenas um códon foi inferior mesmo adicionando à rede uma camada intermediária Habilidade de um sistema de aprendizado é dependente da representação dos atributos Craven e Shavlik (1993b): resultados e discussões semelhantes Verificação das ORFs após identificação dos exons Farber et al. (1992)

Regiões codificadoras (5/8) Uberbacher e Mural (1991): reconhecimento exons e introns Módulo do servidor GRAIL Atributos de entrada: calculados por algoritmos que avaliam 7 diferentes características da seqüência Freqüência que cada nucleotídeo ocupa cada posição Preferências em tuplas de seis nucleotídeos RN  combinacão das informações (pesos) Janelas de 99 nucleotídeos 19 genes humanos: 90 % de precisão

Regiões codificadoras (6/8) Craven e Shavlik (1993a): previsão de ORFs em bactérias E. coli Grande parte de seu genoma é codificante Resultados comparados a métodos Bayesianos baseados em preferências de códons RN treinada de forma a predizer a posição do códon que o nucleotídeo no centro da seqüência ocupa Seis saídas: Posições 1, 2 e 3 na fita submetida Posições 4, 5 e 6 para a fita complementar

Regiões codificadoras (7/8) Diferentes formas de codificação para as entradas Nucleotídeos na forma canônica Contagem de freqüência de códons na janela Medidas similares às de Uberbacher e Mural (1991), adaptadas para organismos procariotos Combinação das probabilidades providas pelo método Bayesiano com as medidas adaptadas Janelas 61 nucleotídeos Craven e Shavlik. (1993a)

Regiões codificadoras (8/8) Resultados: porcentagem de janelas para as quais gerou-se uma ORF correta Maior poder preditivo das abordagens envolvendo manipulações nos atributos Confirma que a representação das entradas da RN tem papel crucial no desempenho Craven e Shavlik. (1993a)

Combinação de Métodos (1/9) Sistemas de identificação de genes não se baseiam em buscas de sinais ou de conteúdo exclusivamente Abordagens mais promissoras: combinação das duas estratégias de busca GRAIL II GeneID GeneParser2

Combinação de Métodos (2/9) Alguns sistemas também utilizam buscas por similiridade para confirmar suas previsões GeneID+ GeneParser3 Estruturas gênicas identificadas são: Traduzidas em cadeias de aminoácidos Comparadas com seqüências em bases proteicas Pontuadas de acordo com sua similaridade

Combinação de Métodos (3/9) Técnicas de AM são empregadas em uma ou mais etapas da predição gênica Predição da estrutura gênica é complexa e envolve a combinação de vários passos e técnicas Exemplo: sistema GRAIL II

Combinação de Métodos (4/9) GRAIL II: Passo 1: Geração de exons candidatos Identificação de sítios doadores e receptores RN atribui pontuação indicando se a junção identificada é um sítio verdadeiro Pool de exons candidatos é gerado Restrições: Restrições: possuir fase de leitura e ser “intermediado” por um par de junções receptoras e doadoras com pontuação acima de um limiar

Combinação de Métodos (5/9) GRAIL II: Passo 2: Eliminação de candidatos improváveis Série de medidas e regras heurísticas são aplicadas aos exons candidatos Aplicação leva à eliminação de grande parte dos exons candidatos (aproximadamente 90%)

Combinação de Métodos (6/9) GRAIL II: Passo 3: Avaliação dos exons Exons remanescentes são avaliados por uma RN Pontuação Exon 6-mer in-frame (Isochore) 6-mer in-frame (Candidato) Composição GC do Exon Doador... Receptor Composição GC (Isochore)

Combinação de Métodos (7/9) GRAIL II: Passo 4: Geração do modelo do gene Algoritmo de programação dinâmica é aplicado na montagem do gene Baseado em suas pontuações Também são checadas se algumas restrições são satisfeitas Outros sistemas diferem nas técnicas e passos

Combinação de Métodos (8/9) Burset e Guigó (1996): compararam diversos sistemas para predição da estrutura de genes eucariotos Deficiências comuns: Não há metodologia padrão na obtenção das acurácias Acurácias se mostraram menores que as reportadas Acurácia dos programas está ligada aos conjuntos de treinamento empregados em sua geração Acurácia dos sistemas foi afetada presença de ruídos nos dados

Combinação de Métodos (9/9) Burset e Guigó (1996) também apontaram que o emprego de buscas por similaridade mostra-se uma estratégia promissora Combinação da saída de vários programas também pode trazer benefícios Todos programas predizem um mesmo exon  (quase certamente) pode ser considerado correto