TÉCNICAS LABORATORIAIS PARA DIAGNÓSTICO DE COCCÍDEOS Alexandre J. Silva – CDC/Atlanta/GA/USA Aula ministrada em Julho de 2002 Última atualização em Novembro de 2006

CRYPTOSPORIDIUM PONTOS CHAVES PARA O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL I PRINCÍPIOS BÁSICOS: a) Amostras fecais múltiplas (ao menos 3)* devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretação de diagnóstico negativa. b) Para maximizar a recuperação de oocistos, amostras fecais devem ser concentradas antes do exame microscópico (por exemplo, centrifugação a 500 X g, 10 min, por método da formalina-acetato de etila). Amostras a serem processadas pelo teste imunoenzimático não devem ser concentradas, pois antígenos se perderão durante o procedimento! c) A escolha das técnicas diagnósticas depende da disponibilidade de equipamentos e reagentes, experiência e considerações quanto a tempo e custo dos exames. Os métodos mais freqüentemente usados incluem: 1. TESTE DE ANTICORPO FLUORESCENTE DIRETO (Imunofluorescência = IF): Oocistos (4-6 µm) adquirem fluorescência verde-maçã. Esta técnica oferece a mais alta combinação de sensibilidade e especicidade e é considerada o “padrão ouro” por muitos laboratórios. Entretanto, ela não proporciona um registro permanente como o faz a lâmina corada que pode ser arquivada, além de requerer equipamento especial (microscópio fluorescente) e a compra de reagentes comercialmente disponíveis. 2. TESTE IMUNOENZIMÁTICO (ELISA): As amostas não devem ser concentradas antes de serem testadas. Antígenos de Cryptosporidium são detectados nas fezes por este método (Amostras positivas próximas ao limiar de reatividade precisam ser confirmadas por IF). O ELISA não depende de prática em microscopia, tem elevada sensibilidade e especificidade, e é util em levantamentos com grande número de amostras em curto espaço de tempo. Entretanto, ele exige equipamento especial (Leitor de microplacas) e aquisição de reagentes comercialmente disponíveis. 3. COLORAÇÃO DE KINYOUN (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA): Oocistos (4-6 µm) frequentemente se apresentam com sua parede evidente e se coram de rosa claro a vermelho brilhante. Entretanto, a coloração pode ser variável: infecções em fase de recuperação, em particular, podem ter oocistos “fantasmas” não corados. Oocistos maduros podem ter esporozoitas visíveis (até 4). Este método é o mais fácil e prático e proporciona obtenção de registro permanente. Erros de diagnóstico podem acontecer, todavia, em decorrência da variabilidade nas colorações e confusão com artefatos.*O conceito de uso de multiplas amostras de fezes está atualmente sobre revisão. Alguns estudos tem mostrado que a primeira amostra é suficiente para proporcionar diagnósticos precisos em 90% dos casos. Oocistos de Crryptosporidium parvum (seta) e cistos de Giardia intestinalis (à direita) corados com anticorpos fluorescentes. Esfregaço de fezes contendo oocistos de Cryptosporidium parvum corados pela técnica de Kinyoun (álcool-ácido-resistente modificado)

CRYPTOSPORIDIUM PONTOS CHAVES PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL II 4. COLORAÇÃO PELA SAFRANINA: Oocistos de Cryptosporidium freqüentemente (mas não sempre) adquirem uma coloração vermelho-alaranjada brilhante. Este método, recomendado para Cyclospora, não é muito usado para Cryptosporidium, pois os oocistos de Cryptosporidium nem sempre se coram. 5. MONTAGEM A FRESCO: Em microscópio de campo claro, oocistos aparecem como pequenas estruturas arredondadas (4 - 6 µm) semelhantes a leveduras. Eles não apresentam autofluorescência. Este método é menos útil para Cryptosporidium que para Cyclospora, especialmente quando pequeno números de oocistos podem ser confundidos por outros elementos fecais.   6. COLORAÇÃO PELO TRICRÔMIO (ou tricromo): Oocistos aparecem como pequenas estruturas redondas medindo de 4 a 6 µm. A coloração pelo tricrômio é uma técnica de coloração permanente de rotina para amostras de fezes na maioria dos laboratóiros, e os técnicos devem estar familiarizados com a aparência do Cryptosporidium corado com tricromo. Este método de coloração é, entretanto, inadequado para diagnóstico definitivo, pois os oocistos aparecerão não corados, dificultando o estudo morfológico. O método de Kinyoun (álcool-ácido-resistente modificado) é um método de coloração facil e o mais prático para realização de um diagnóstico acurado. DIFERECIAÇÃO ENTRE OOCISTOS DE CYCLOSPORA vs CRYPTOSPORIDIUM  Tamanho: Cyclospora 8-10 µm; Cryptosporidium 4-6 µm. Esporozoítas: não visíveis no interior de oocistos de Cyclospora, podem sre discerníveis nos oocistos de Cryptosporidium Autofluorescência: presente no Cyclospora, ausente no Cryptosporidium. Teste de Anticorpo Fluorescente Direto: disponível para Cryptosporidium. Teste Imunoenzimático (ELISA): disponível para Cryptosporidium. Esfregaço de fezes contendo oocistos de Cryptosporidium parvum corados pela técnica de coloração pela safranina.

CYCLOSPORA PONTOS CHAVES PARA O DIAGNÓSTICO LABORATORIAL I Princípios básicos: a) Amostras fecais múltiplas (ao menos 3)* devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretação de diagnóstico negativa. b) Para maximizar a recuperação de oocistos, amostras fecais devem ser concentradas antes do um exame microscópico (por exemplo, centrifugação a 500 X g, 10 min, por método da formalina-acetato de etila). c) A escolha das técnicas diagnósticas depende da disponibilidade de equipamentos e reagentes, experiência e considerações quanto a tempo e custo dos exames. Os métodos mais freqüentemente usados incluem: 1. Montagem a fresco: Sob microscopia de campo claro (contraste de fase ou DIC=differential interference contrast), oocistos se apresentam como esferas refringentes (8-10 µm), com uma parede distinta. Entretanto, outros objetos podem apresentar características semelhantes. Sob microscopia de fluorescência-UV, a parede do oocisto adquire autofluorescência. Uma intensa fluorescência azul é observada utilizando-se conjunto de filtros de excitação UV na faixa de 330-365 nm. Se este conjunto de filtros não for disponível, uma fluorescência verde de menor intensidade pode ser observada com filtro de excitação azul (450-490 nm). Outros abjetos podem, entretanto, adquirir autofluorescência também. A utilização de microscópio com ambos os tipos de iluminação, campo claro e de fluorescência UV, constitui procedimento de diagnóstico eficiente e confiavel, quando presença de objetos autofluorescentes podem ser conferidos por observação em campo claro (e vice versa). Entretanto, isto requer um microscópio de fluorescência e não fornece um registro permanente como proporcionaria a lâmina corada que pode ser arquivada. 2. COLORAÇÃO DE KINYOUN (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA): Um fundo azul-esverdeado da preparação fecal permite que os oocistos se sobressaiam. Estes se coram de forma variável: alguns se tingirão de rosa claro a púrpura intensa, enquanto outros podem não ficar corados.. Os oocistos (8-10 µm) podem não ser perfeitamente redondos; alguns podem se apresentar em colapso ou distorcidos em um dos lados. * O conceito quanto ao uso de amostras fecais múltiplas está atualmente sobre revisão. Alguns estudos tem demonstrado que a primeira amostra é suficiente para proporcionar diagnóstico preciso em 90% dos casos. Scale bar = 10 μm Scale bar = 10 μm Esfregaço de fezes contendo oocistos de Cyclospora cayetanensis corados pela técnica de Ziehl-Neelsen modificada (álcool-ácido-resistência modificada).

CYCLOSPORA PONTOS CHAVES PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL II COLORAÇÃO DE KINYOUN (CONTINUAÇÃO): Eles podem conter grânulos e/ou ter parede de oocisto com aparência enrugada (características que distinguem oocistos de artefatos de coloração). Este método de coloração é o mais fácil, e o mais prático, e permite um registro permanente. Além disso, as lâminas não precisam ser examinadas dentro de um período de tempo rígido e ficam disponíveis para arquivamento. Entretanto, erros de diagnóstico podem ocorrer em decorrência da variabilidade nas colorações e confusão com artefatos. 3. COLORAÇÃO PELA SAFRANINA: Oocistos se coram uniformemente em vermelho a vermelho-alaranjado. Esta coloração uniforme diminui o risco de erros de diagnóstico. Entretanto esta técnica requer aquecimento, e portanto equipamento adicional é necessário (ex: forno de microondas).   4. COLORAÇÃO PELO TRICRÔMIO (ou tricromo): (Oocistos podem ser detectados, mas não podem ser confirmados por este método) Oocistos aparecem como esferas (8-10 µm) claras, arredondadas e ligeiramente enrugadas. A coloração pelo tricrômio é o método de coloração permanente na rotina da maioria dos laboratórios, e os técnicos devem estar familiarizados com a aparência da Cyclospora corada com tricromo para que os oocistos possam ser detectados nos exames de rotina. Este método de coloração é, entretanto, inadequado para diagnóstico definitivo, pois os oocistos aparecerão não corados, dificultando o estudo morfológico. Vale lembrar que os oocistos se coram de forma variável pela técnica de Kinyoun e mais uniformemente pelo método da safranina. As técnicas de diagnóstico acima referidas devem ser usadas para confirmação de Cyclospora quando este organismo é suspeito no corante tricromo. DIFERENCIAÇÃO ENTRE OOCISTOS DE CYCLOSPORA vs CRYPTOSPORIDIUM   Tamanho: Cyclospora 8-10 µm; Cryptosporidium 4-6 µm.   Esporozoítas: não visíveis no interior de oocistos de Cyclospora; podem ser discerníveis nos oocistos de Cryptosporidium   Autofluorescência: presente na Cyclospora, ausente no Cryptosporidium. Teste de Anticorpo Fluorescente Direto: disponível para Cryptosporidium. Teste Imunoenzimático (ELISA): disponível para Cryptosporidium. Esfregaço de fezes contendo oocistos de Cyclospora cayetanensis corados pela técnica da safranina.

ISOSPORA BELLI PONTOS CHAVES PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL I PRINCÍPIOS BÁSICOS: a) Amostras fecais múltiplas (ao menos 3)* devem ser testadas antes de ser considerada uma interpretação de diagnóstico negativo. b) Para maximizar a recuperação de oocisto, amostras de fezes devem ser concentradas antes de um exame microscópico (por exemplo, centrifugação a 500 X g, 10 min., por método da formalina-acetato de etila). c) A escolha da técnica de diagnóstico depende da disponibilidade de equipamentos e reagentes, experiência e considerações quanto a tempo e custo dos exames. Os métodos mais freqüentemente usados incluem: 1. MONTAGEM A FRESCO: Ao microscópio de campo claro, os oocistos são grandes (25 a 30 por 10 a 19 µm) e apresentam uma forma elipsóide típica (fig. A eB). Oocistos esporulados (fig. B)podem ser observados se a amostra fecal contendo este coccídeo for armazenado em dicromato de potássio por mais de dois dias, à temperatura ambiente. Oocistos de Isospora belli podem ser visualizados em montagens a fresco, sob microscopia fluorescente, como ilustrado na fig.C. Uma intensa fluorescência azul é observada utilizando-se conjunto de filtros de excitação ultravioleta na faixa de 330-365 nm. Se este conjunto de filtros não for disponível, uma fluorescência verde de menor intensidade pode ser observada de excitação azul (450-490 nm). Outros objetos, todavia, podem também adquirir fluorescência. A utilização de microscópio com ambos os tipos de iluminação, campo claro e de fluorescência UV, constitui o procedimento de diagnóstico eficiente e confiável, quando a presença de objetos autofluorescentes podem ser conferidos por observação em campo claro e vice versa. Entretanto, isto requer um microscópio de fluorescência e não fornece registro permanente como proporcionaria a lâmina corada que pode ser arquivada.   2. COLORAÇÃO DE KINYOUN (ZIEHL-NEELSEN MODIFICADA): Um fundo azul esverdeado preparação fecal, ou outra coloração contrastante, permite que os oocistos se sobressaiam. Estes se coram de forma variável: alguns se tingirão de rosa claro à púrpura intensa, enquanto outros podem permanecer não corados. Os oocistos (25 a 30 µm) terão um formato elipsóide típico como mostrado na montagem a fresco, e suas estruturas internas não serão bem visualizadas. Alguns oocistos podem aparecer em colapso ou distorcidos em um dos lados.  A B C Esfregaço de fezes contendo um oocisto de Isospora belli corado pela técnica de Kinyoun (ácool-ácido-resistência modificado). * O conceito quanto ao uso de amostras fecais múltiplas está atualmente sobre revisão. Alguns estudos têm demonstrado que a primeira amostra é geralmente suficiente para proporcionar diagnóstico preciso em 90% dos casos.

ISOSPORA BELLI PONTOS CHAVES PARA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL II COLORAÇÃO DE KINYOUN (CONTINUAÇÃO): Este método de coloração é o mais fácil, e o mais prático, e proporciona um registro permanente. Além disso, as lâminas não precisam ser examinadas dentro de um período de tempo rígido e ficam disponíveis para arquivamento. Entretanto, erros de diagnóstico podem ocorrer em decorrência da variabilidade de colorações e artefatos. 3. COLORAÇÃO PELA SAFRANINA: Oocistos se coram uniformemente em vermelho a vermelho-alaranjado. Os oocistos (25 à 30 µm) terão formato elipsóide típico como na montagem a fresco e sua estrutura interna pode não estar bem visualizada. Alguns oocistos podem se apresentar em colapso ou distorcidos em um dos lados. Esta técnica requer aquecimento, portanto equipamento adicional é necessário (ex: forno microondas). Esfregaço de fezes contendo um oocisto de Isospora belli corado pela técnica de safranina. PONTOS CHAVES PARA IDENTIFICAÇÃO DE OOCISTOS DE ISOSPORA BELLI Tamanho: 25 a 30 por 10 a 19 µm. Esporozoítas: podem ser vistos em oocistos maturados fora do corpo. Autofluorescência: presente. Teste de Anticorpo Fluorescente Direto: nenhum. Teste Imunoenzimático: nenhum. Safer · Healthier · People

Cyclospora sp., Cryptosporidium sp., and Isospora belli Oocistos em esfregaço de fezes corado por técnica de Ziehl-Neelsen modificada: A -Cryptosporidium parvum; B - Cyclospora cayetanensis; C - Isospora belli. Oocistos em esfregaço de fezes corado por técnica do azul-de-metilenosafranina: D -Cryptosporidium parvum; E - Cyclospora cayetanensis; F - Isospora belli. Cyclospora cayetanensis em preparações a fresco: A a D - Microscopia de contraste de fase A - Seqüência mostrando evento de esporulação a partir de um oocoisto não esporulado (à esquerda) até um oocisto esporulado contendo dois esporocistos (à direita) B - Oocisto rompido lliberando um esporocisto C - Esporocistos liberando esporozoítos (dois esporozoítos livres podem ser observados ) D - Oocisto não esporulado E - Microscopia de epifluorescência Safer · Healthier · People

Cyclospora sp., Cryptosporidium sp., and Isospora belli F Oocistos em esfregaço de fezes corado por técnica de Ziehl-Neelsen modificada: A -Cryptosporidium parvum; B - Cyclospora cayetanensis; C - Isospora belli. Oocistos em esfregaço de fezes corado por técnica do azul-de-metilenosafranina: D -Cryptosporidium parvum; E - Cyclospora cayetanensis; F - Isospora belli. G H I Montagem a fresco: G – Cyclospora cayetanensis - seqüência mostrando evento de esporulação a partir de um oocisto não esporulado (à esquerda) até um oocisto esporulado contendo dois esporocistos (à direita); H – Isospora belli; I - Microscopia de epifluorescência. Safer · Healthier · People