CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA Curso de Verão em Bioinformática CONTROLE DA EXPRESSÃO GÊNICA DALILA L. ZANETTE

O DNA codifica as diferentes proteínas Proteínas: unidades funcionais e estruturais de todos os organismos Estrutura dos organismos Enzimas que catalisam as reações bioquímicas Hormônios

Nucleotídeo – unidade básica do DNA Nucleotídeo : pentose (desoxirribose) + base nitrogenada + fosfato Purinas Pirimidinas

Estrutura do DNA Os nucleotídeos se ligam uns aos outros de forma linear – ligação fosfodiéster

sintetizado no núcleo a partir do DNA Estrutura do RNA Pentose : ribose (diferente do DNA) No lugar da timina, no caso do RNA, uracila RNA mensageiro sintetizado no núcleo a partir do DNA TRANSCRIÇÃO

Código genético A cada 3 nucleotídeos no DNA, forma-se um CÓDON A seqüência destes códons no DNA é copiada em RNA mensageiro Cada códon codifica um aminoácido, que é a unidade básica da estrutura das proteínas A seqüência dos aminoácidos, determinada pela sequência de códons é que dá origem às diferentes proteínas

Códons

Dogma central da biologia molecular Proteínas

Dogma central da biologia molecular

Informação para síntese protéica

Conceito de gene Um segmento de DNA que tem a informação necessária para a síntese de uma proteína Composto por : regiões codificantes – éxons regiões não-codificantes - íntrons

Estrutura do gene INTRONS 3` 5` EXONS As regiões codificadoras são chamadas de éxons e são alternadas por regiões não-codificadoras, chamadas de íntrons

Estrutura do gene Posteriormente, ocorre o splicing para retirada dos introns, ficando somente a parte codificadora do gene, para orientar a tradução da proteína

Diferentes tipos celulares DNA – igual para todas as células do mesmo indivíduo No entanto, temos tipos especializados de células, que são bastante diferentes entre si Além das diferentes células que temos, também existem diferentes situações nas quais nossas células são modificadas em resposta a um estímulo Ex. uso de medicamentos, alterações hormonais e doenças

EXEMPLOS DE DIFERENTES CÉLULAS epitelial Célula muscular Neurônios Células do tecido conectivo

O que torna uma célula diferente da outra? Organismos multicelulares Síntese e acúmulo de diferentes RNAs e proteínas torna uma célula diferente da outra Apesar da sequência de DNA ser a mesma para todas as células Raras exceções, como os rearranjos que conferem a diversidade do sistema imunológico

Como as células diferem umas das outras ? 1. Processos comuns a todas as células - proteínas em comum 2. Algumas proteínas são encontradas somente em células altamente especializadas 3. RNAs mensageiros - qualidade e quantidade 4. Há outras diferenças além do RNA. Exemplo: fatores pós-traducionais

Dogma central da biologia molecular Igual para todas as células Transcrição Diferentes RNAs podem ser gerados Tradução A descoberta de combinacoes alternativas de exons, ou seja, do splicing alternativo. Definição antiga – região do genoma gerada como unidade separada na meiose e que dá origem a uma caracteristica fenotípica. Um gene, uma proteina. Depois veio outra definição para gene: sequencia de DNA que é transcrita em RNA e codifica uma proteina Com a descoberta do splicing: sequencia de DNA que é transcrita como unidade separada e que codifica um grupo de proteínas semelhantes (isoformas) Diferentes proteínas podem ser geradas

Níveis de regulação da expressão gênica - Antes da transcrição Após a transcrição (pós-transcricionais) Mecanismos pós-traducionais – vários entre eles, mecanismos epigenéticos

Níveis de regulação da expressão gênica DNA RNA Proteína

Antes da transcrição Entre o DNA e o RNA

Fatores cis e trans • Fatores Trans-Atuantes Genes que codificam estes fatores de regulação estão em outra região da molécula de DNA, tendo que migrar ao local de ação • Fatores Cis-Atuantes Seqüências reguladoras, região de ligação dos fatores trans-atuantes, estão na mesma molécula que o gene, ou transcrito de RNA, que está sendo regulado

Fatores cis e trans Fatores cis Estão na fita de DNA. São as regiões reguladoras, como as regiões promotoras dos genes, que são regiões que podem “ligar ou desligar”a expressão do gene Fatores trans Ligam-se ao DNA, mas provém de outra região do DNA, que os codifica para agirem sobre os fatores em cis

Fatores cis e trans Ativadores Repressores Reforçadores Elementos isolantes As moléculas de DNA possuem regiões reguladoras próximas ao sítio onde a transcrição começa São “botões de liga e desliga” que possuem fundamentalmente: Um trecho pequeno de DNA com uma sequência definida; proteínas reguladoras que reconhecem e se ligam a essas sequências Regiões reguladoras e regiões promotoras

Início da transcrição: ATIVADORES – FATORES CIS Forma mais simples Ativadores: Atraem, posicionam e modificam os fatores de transcrição e a RNA pol II Ativadores – possuem dois domínios distintos: um que reconhece uma sequencia de DNA reguladora; e outro domínio, que acelera o início da transcrição. Uma vez ligados ao DNA, os ativadores atraem, organizam e modificam os fatores de transcrição e a RNA pol II junto ao promotor, para que a transcricão se inicie. Eles fazem isso agindo diretamente na maquinaria de transcrição e tb modificando a estrutura da cromatina perto do promotor. Os fatores de transcrição e a polimerase podem se montar passo a passo, num processo mais complexo, ou já chegar ao promotor unidos em um complexo pré-formado chamado holoenzima RNA pol II , que contem tipicamente um complexo de 20 subunidades chamado de mediador. No caso do complexo pré-formado, os ativadores interagem com o complexo holoenzima tornando-o mais energeticamente favorável para se unir ao promotor– atalho do ativador Ativadores – dois sítios

Ativadores que agem à distância Enhacers ou reforçadores aumentam a transcrição do gene Podem agir à distância Acima ou abaixo  O DNA faz uma alça Os ativadores se ligam a regioes de DNA que são chamadas de reforçadores (enhancers), uma vez que a sua presença aumentava dramaticamente a taxa de transcrição . Só que os ativadores e reforçadores podem agir mesmo estando muito distantes do promotor. Como ocorre isso? O DNA entre o enhancer e o promotor faz uma alça que permite que os ativadores ligados ao enhancer entrem em contato com as proteinas (RNA polimerase, fatores de transcrição, etc. ) que estão ligadas ao promotor. O DNA age então como uma corda, ajudando na interação das proteínas ligadas ao enhacer com as proteínas ligadas ao promotor.

Como os fatores de transcrição acessam o DNA-alvo ? DNA – empacotado para ocupar menos espaço na célula Organização de DNA, RNA e proteínas HISTONAS em um complexo chamado CROMATINA Histonas – proteínas que compõe a cromatina Heterocromatina DNA condensado Eucromatina – DNA estendido

Estrutura do DNA : nucleossomos e cromatina Unidade básica da heterocromatina NUCLEOSSOMOS Nucleossomos: aproximadamente 147 nucleotídeos enrolados sobre um octâmero de histonas com 2 cópias de cada tipo de histona

Estrutura do DNA : cromossomos e cromatina DNA dupla hélice Nucleossomos Contas de colar Os nucleossomos se enrolam Cromossomo na sua forma estendida Cromossomo na sua forma condensada Cromossomo mitótico inteiro Resultado : o cromossomo empacotado é 10.000 vezes menor do que sua forma estendida

Ativadores podem modificar a cromatina Organização em nucleossomos – Acesso dos fatores de transcrição através de modificações na cromatina Para ativação das regiões promotoras, Ocorre recrutamento de histona-acetiliases e complexos de remodelagem da cromatina Cromatina acetilada – ativa, desenrolada Fácil acesso dos fatores de transcrição e da RNA polimerase II às regioes reguladoras do gene Os ativadores tb promovem a transcrição modificando a estrutura da cromatina das regioes reguladoras e promotoras. Essas modificações podem ser através de modificações covalentes das histonas e/ou remodelagem de nucleossomos. Os ativadores recrutam histona-acetil-transferases (HATs) e complexos remodeladores de cromatina dependentes de ATP. As modificações na cromatina garantem maior acessibilidade dos fatores de transcrição e da holo-pol II ao promotor, além de permitir a ligação de proteínas reguladoras adicionais. Como os fatores não conseguem acessar um promotor empacotado em um nucleossomo, essa é mais uma forma de evitar ativaçao errada da transcriçao.

Ativadores e cromatina Ativador se liga ao DNA Complexo de remodelagem da cromatina Remodelagem da cromatina Enzimas modificadoras das histonas: histona-acetilases Modificação covalente das histonas Outros ativadores Outros ativadores ligados às regiões reguladoras Fatores de transcrição e RNA pol II conseguem acessar o DNA Montagem do complexo de iniciação no promotor Outros ativadores e rearranjo das proteínas do complexo INÍCIO DA TRANSCRIÇÃO

Repressores Repressão de grandes regiões - heterocromatina Repressão local : várias maneiras, podendo haver: Ativador e repressor competem pela mesma região reguladora do DNA O repressor se liga à região de ativação, mascarando-a e impedindo a ligação do ativador O repressor interage com o complexo de transcrição antes que ele esteja pronto, impedindo seu funcionamento 4. Recrutamento de complexos de remodelagem de cromatina, que podem compactar o DNA 5. Os repressores recrutam histona-desacetilases, que vão inativar a cromatina, compactando-a Competição pela ligação ao DNA – ativador e repressor competem pela mesma sequencia reguladora de DNA Mascarando a superfície de ativaçào – nesse caso, as duas proteinas podem se ligar ao DNA, mas o repressor se liga ao domínio de ativação da proteina ativadora impedindo sua ação Interação indireta com fatores de transcrição – o repressor interage com uma forma imatura do complexo de transcricao e impede a sua montagem Recrutamento de complexos de remodelagem de cromatina repressivos – estes complexos fazem com que o nucleossomo retorne ao seu estado de nucleossomo. Estes mesmos complexos podem agir tanto para reprimir quanto para ativar a transcrição, dependendo da concentracao de outras proteinas no nucleo, qualquer uma das formas, ativa ou inativa, pode ser estabilizada. É como se esse complexo simplesmente permitisse a remodelagem da cromatina, para qualquer forma. Recrutamento de histona-desacetilases – o repressor atrai a histona-desacetilase até o promotor. A desacetilação local reduz a afinidade do TFIID pelo promotor e diminui a acessibilidade ao DNA na cromatina afetada. Existe ainda um sexto mecanismo, que é a inativação de um ativador através de heterodimerização.

Complexos de proteínas reguladoras Geralmente ocorre formação de complexos distintos que se formam de forma específica frente à região de DNA apropriada As proteínas reguladoras não têm função fixa, elas poderão agir como ativadoras ou repressoras dependendo da região que estão regulando As unidades reguladoras que geram os complexos, vão se unir, formando uma determinada combinação que por sua vez, irá determinar se aquele complexo irá ativar ou reprimir a transcrição A maioria das proteínas reguladoras agem como partes de um complexo composto por vários polipeptídeos, cada um com funções distintas. Estes complexos se formam somente na presença da sequencia de DNA apropriada. Uma proteina reguladora pode agir em mais de um complexo. Por exemplo, em um caso como parte do complexo de ativação e em outro caso como parte de um complexo de repressão. Assim, estas proteinas não são necessariamente ativadoras ou repressoras, ao contrario, elas funcionam como unidades reguladoras usadas para gerar complexos cuja função depende da montagem final de todos os componentes. Esta montagem final, por sua vez, depende tanto da disposição da sequencia de DNA reguladora, quanto das proteínas reguladoras presentes na célula. Co-ativadores Co-repressores

Região de controle gênica Região de controle gênica – todo o DNA envolvido na regulação de um gene Quantidade de proteínas reguladoras de genes Fatores de transcrição Proteínas reguladoras RNA POL II Proteínas reguladoras GENE- segmento de DNA transcrito em RNA ( termo geral e antigo) . Hoje, deve-se incluir a regiao de controle como parte do gene. Promotor – onde estão os fatores de transcrição e a polimerase. Também é onde todas as sequencias reguladoras às quais as proteinas reguladoras se ligam para controlar a montagem do complexo junto ao promotor Mesmo o DNA que fica entre regioes reguladoras que serve como espaçador Deve ser considerado, pq facilita a transcrição É importante lembrar que grande parte do DNA das regioes reguladoras está empacotado em nucleossomos e outras ordens maiores de organização da cromatina, diminuindo sua extensão. Fatores de transcrição são poucos, mas as proteinas reguladoras são muitas, tanto que se estima que dos 30.000 genes que supostamente existam, 5-10% codifiquem proteinas reguladoras dos genes. Sequencias reguladoras promotor DNA espaçador

Controle pós-transcricional O controle antes da transcrição é mais determinante Pos transcricional – todos os controles depois que a RNA pol já está ligada ao promotor

Processamento normal do RNA  SPLICING: retirada dos introns, ficam somente os exons

Processamento normal do RNA Capeamento Logo após a transcrição Ligação efetiva de 7-metilguanosina ao primeiro nucleotídeo 5’ do transcrito de RNA. Protege o transcrito do ataque da exonuclease 5’→3’ Facilita o transporte do RNAm para citoplasma Papel no encaixe da subunidade 40S dos ribossomos no mRNA Poli-adenilação Após o término da transcrição – clivagem terminal do RNA Adição de cerca de 200 resíduos de adenilato . Facilitar transporte para o citoplasma . Estabilizar o RNAm . Facilita a tradução

Processamento normal do RNA 5’ CAP RNAm AAAAAAAA 3’ 5’ m7G Cauda poli-A

Controle pós-transcricional : splicing alternativo Os genes eucarioticos podem ter tamanhos diferentes gerados por splicing do RNA. O termo splicing quer dizer combinação. Neste processo as sequencias dos introns são removidas do RNA mensageiro. Uma célula pode dividir o transcrito primário de diferentes maneiras, o que irá gerar polipeptídeos diferentes originados do mesmo gene, porém de transcritos diferentes. Neste caso, em que várias isoformas são geradas, diz-se que ocorre splicing alternativo. Pelo menos um terço dos genes humanos produzem multiplas proteinas dessa forma. Quando existe possibilidade de combinações diferentes em várias posições do transcrito, um único gene pode produzir várias proteinas diferentes. Assim, a compelxidade protéica de uma célula ultrapassa muito o número de genes que ela possui. Combinações diferentes de éxons – um gene, várias proteínas

Tipos de splicing alternativo Entretanto, o splicing é mais regulado do que constitutivo. No mais simples dos exemplos, este mecanismo é usado para mudar a produção de uma forma não-funcional da proteína para uma forma funcional. Outra possibilidade é a geração de variantes da proteina pra tipos celulares diferentes, gerando isoformas célula-específicas. Regulação negativa do splicing – reguladores impedem que a maquinaria de splicing cheguem no sítio do gene Regulação positiva do splicing – regulador ajuda a maquinaria a chegar a um sítio que esteja de dificil acesso.

O que são os genes ? Genes são sequências de DNA transcritas como uma unidade que geram uma determinada proteína Mecanismos de controle da expressão gênica podem gerar diferentes transcritos, variantes do mesmo gene, como o mecanismo de splicing alternativo Sequências de DNA transcritas como uma unidade que codificam um grupo de proteínas semelhantes (isoformas)

Regulação do transporte de RNA Somente RNAm com estrutura de 5`cap e cauda poli–A vão para o citoplasma Grande parte dos RNAs mensageiros nem saem do núcleo O RNAm pode ir para locais específicos no citoplasma, próximo de onde a proteína atua Região 3`- UTR é que quem regula esse direcionamento

Estabilidade dos RNAs mensageiros RNA mensageiro instável – codificam proteínas cujas taxas de produção mudam rápido dentro da célula Fatores externos também influenciam Degradação do RNAm – sequência do RNA A maioria dos RNAs mensageiros são instáveis. Alguns, como o da beta-globina no entanto, tem meia-vida de mais de 10 horas. Outros, têm meia-vida de menos de 30 minutos. Os RNAs mais instáveis geralmente codificam proteínas reguladoras, como fatores de crescimento e reguladores da expressão genica, cuja produção muda rápido nas células. Existem duas vias de degradação do RNAm, e é a sequencia do RNAm que determina a via e a cinética da degradação. A via mais comum envolve o encurtamento gradual da cauda poli-A, que ocorre no citoplasma devido à ação de uma exonuclease. Quando encurta a ponto de sobrarem cerca de 30 As, o 5`-cap é removido e ocorre rapidamente a degradação do RNAm. Quase todos os RNAs estao sujeitos a essa via de degradação, mas a taxa em que isso ocorre é diferente para cada espécie de RNAm. As proteínas que catalisam a tradução competem diretamente com as que encurtam as caudas poli-A, assim, qualquer fator que afete a tradução vai ter o efeito oposto sobre a degradação do RNAm. Alem disso, alguns RNAm carregam em suas 3`-UTRs sitios de ligação que aumentam ou diminuem a taxa de encurtamento das caudas poli-A. por exemplo, RNAs instáveis tem bastante sequencias AU, que aumentam a taxa de encurtamento. A segunda via é através de clivagem da cauda poli-A por endonucleases específicas, que cortam a cauda poli-A inteira. Os RNAm que são degradados assim tem nucleotideos na 3`-UTR que servem de sitio de reconhecimento para essas endonucleases. Encurtamento da cauda poli-A Clivagem da cauda poli-A por endonucleases

Mecanismos para a criação de células especializadas Em organismos multicelulares, as células se diferenciam e se tornam altamente especializadas. Umas vez que uma célula se compromete, essa escolha é geralmente mantida por várias gerações, o que significa que as mudanças na expressao genica envolvidas devem ser lembradas. Este fenomeno de memória celular é um pre-requisito para a criaçao de tecidos organizadaos e para a manutençao de tipos celulares diferenciados e estáveis. Já as alterações mais simples de expressão são transitórias. Apesar de ser um processo controlado por várias proteinas em combinação, uma única proteina envolvida na ativacao de um determinado gene pode ser decisivo, pq só todos os fatores juntos é que completam o processo. Isso é um fator importante para permitir alteracoes rápidas na expressao e que são algumas vezes necessárias. Por exemplo uma proteina reguladora que age sobre diversos genes, pode ser usada para regular a expressao de todos eles. As diferenças dramáticas que existem entre os diferentes tipos celulares é produzida por diferenças na expressão gênica

Estudo da expressão gênica Para ajudar a entender os mecanismos que tornam uma célula diferente da outra, seja em organismos diferentes, tecidos diferentes ou situações diferentes O fato de que as células possuem diversos níveis de regulação da expressão gênica indica sua importancia para definir os processos e funções de cada tipo celular ou a resposta de cada célula a uma determinada situação

Estudos globais da expressão gênica: Sequências pequenas de cada gene, que o identificam SAGE Microarrays

Bibliotecas de ESTs: dados mais detalhados Somente as sequências transcritas – EXPRESSED SEQUENCE TAGS Sequências grandes de DNA complentar, gerado a partir do RNA das células O maior número possível de sequências é gerado e sequenciado – BIBLIOTECA Com objetivo de acumular toda a informação possível do TRANSCRIPTOMA das células, ou seja, tornar conhecidas todas as sequências de DNA que são transcritas em RNAm naquela célula