Alinhamentos Múltiplos Curso de Introdução à Bioinformática Programa de Qualificação Docente da CAPES Convênio: UFPE - UFCG - Fiocruz Alinhamentos Múltiplos Marcos Catanho Laboratório de Genômica Funcional e Bioinformática DBBM-IOC / Fiocruz

Agenda Motivação Estratégias de alinhamento múltiplo Dificuldades computacionais Métodos de alinhamento múltiplo Programas de alinhamento múltiplo Dicas importantes Alinhamento global progressivo (ClustalW)

Porque precisamos de alinhamentos múltiplos? Um alinhamento múltiplo, seja de sequências de DNA ou de proteína, pode fornecer muito mais informação do que uma única seqüência. Quando lidando com uma nova proteína, de função desconhecida, a presença de domínios similares a outros em proteínas conhecidas pode implicar em função ou estrutura semelhante.

Porque precisamos de alinhamentos múltiplos? É sabido que a pressão seletiva resulta da necessidade de se conservar uma função. Em proteínas, a manutenção da função requer uma estrutura 3D específica. Portanto, alinhamentos múltiplos de proteínas podem fornecer alguma informação sobre a estrutura 3D das mesmas.

Porque precisamos de alinhamentos múltiplos? Para revelar os relacionamentos entre um grupo de seqüências (homologia). Para caracterizar famílias protéicas – identificar regiões conservadas e determinar as regiões variáveis. Regiões similares podem indicar funções similares (por exemplo, promotores no DNA).

Porque precisamos de alinhamentos múltiplos? Planejar experimentos de mutagênese sítio-dirigida, desenhar primers e/ou sondas especiais. Construir um perfil da família, o que possibilitará buscas mais avançadas, capazes de localizar membros mais distantes da mesma família.

Porque precisamos de alinhamentos múltiplos? Alinhamentos múltiplos são utilizados por programas de modelagem protéica. Podem ajudar na predição das estruturas secundária e terciária de novas seqüências. Alinhamentos múltiplos servem de input para a construção de árvores filogenéticas.

Estratégia Alinhamento par-a-par Busca nos bancos de dados Alinhamento múltiplo

Estratégia Alinhamento múltiplo Modelagem por homologia Análise filogenética Buscas avançadas em bancos de dados: padrões, motivos, sítios

O desafio computacional dos alinhamentos múltiplos Encontrar o alinhamento ótimo de um grupo de seqüências incluindo matches, mismatches e gaps é muito difícil. Para alinhamentos par-a-par, métodos de programação dinâmica são utilizados (Needleman & Wunsch, 1970; Smith & Waterman, 1981), mas estes são inviáveis para alinhamentos múltiplos (exigem tempo de processamento muito longo, proporcional ao produto do tamanho das seqüências).

O desafio computacional dos alinhamentos múltiplos Se alinhar 2 seqüências de 300 resíduos leva 1 segundo, alinhar 3 seqüências do mesmo tamanho levaria 300 segundos, e alinhar 10 seqüências levaria 300^8 segundos, o que é superior à idade do universo!

O desafio computacional dos alinhamentos múltiplos As dificuldades de se alinhar um grupo de seqüências variam conforme o grau de similaridade entre as seqüências. Um alto grau de variação entre as seqüências implica em um grande número de alinhamentos possíveis, o que torna muito difícil encontrar o alinhamento “ótimo”.

O desafio computacional dos alinhamentos múltiplos Métodos aproximados são utilizados ao invés de métodos de programação dinâmica. Outro desafio computacional é a inserção e pontuação de gaps nas seqüências alinhadas.

Métodos aproximados Alinhamento global progressivo: rápido, requer pouca espaço de memória e oferece bom desempenho para seqüências homólogas relativamente bem conservadas.

Métodos aproximados Alinhamento global baseado em blocos: as seqüências a serem comparadas devem compartilhar blocos (domínios) conservados, separados por regiões não conservadas contendo grandes indels.

Métodos aproximados Alinhamento global baseado em motivos: as seqüências a serem comparadas devem compartilhar regiões similares sem, necessariamente, serem relacionadas globalmente.

Programas de alinhamento global progressivo ClustalW http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ T-Cofee http://igs-server.cnrs-mrs.fr/~cnotred/Projects_home_page/t_coffee_home_page.html

Programas de alinhamento global baseado em blocos DIALIGN http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign/

Programas de alinhamento global baseado em motivos BLOCKS http://blocks.fhcrc.org/blocks/ MEME http://meme.sdsc.edu/meme/intro.html

Dicas na escolha de suas seqüências Seqüências retiradas diretamente dos bancos de dados podem conter dados irrelevantes (vários genes, fragmentos de diferentes tamanhos). Cheque suas seqüências e use somente a parte relevante para o alinhamento. Edite e remova as outras partes antes do alinhamento. Tente usar seqüências com aproximadamente o mesmo tamanho para o alinhamento.

Dicas na escolha de suas seqüências De forma geral: Quanto mais seqüências, melhor. Não inclua seqüências muito similares (>80%). Os sub-grupos devem ser alinhados separadamente, e somente um membro de cada sub-grupo deve ser incluído no alinhamento múltiplo final.

O que você necessita saber sobre os programas para a construção de alinhamentos múltiplos Quase todos os programas irão alinhar quaisquer seqüências que o usuário fornecer como input. Sempre retornarão um alinhamento, mesmo que as seqüências não sejam relacionadas entre si.

O que você necessita saber sobre os programas para a construção de alinhamentos múltiplos A maioria dos programas irá inserir gaps. Entretanto, uma vez inseridos, eles estão lá para ficar. Você deve checar como o programa trata a inclusão de gaps nos finais das seqüências.

Alinhamento global progressivo O método mais comumente utilizado para a construção de alinhamentos múltiplos é o alinhamento global progressivo. Como funciona?

ClustalW O ClustalW pode criar alinhamentos múltiplos, editar alinhamentos existentes e criar árvores filogenéticas. O alinhamento pode ser feito por dois métodos: Lento e preciso Rápido e aproximado

ClustalW O seu algoritmo consiste em três etapas: 1. Alinhamentos par-a-par são feitos entre todas as seqüências no grupo em estudo. Uma matriz de distâncias é construída com base em um esquema de pontuação. Ao calcular essa matriz, o programa leva em consideração a divergência entre as seqüências.

ClustalW 2. Uma árvore “guia” (filogenética), que reflete as similaridades entre as seqüências, é construída a partir da matriz de distâncias, utilizando o método de neighbour-joining. Essa árvore-guia tem ramos de diferentes tamanhos. Seu tamanho é proporcional ao tempo de divergência estimado ao longo de cada ramo.

ClustalW 3. O alinhamento progressivo das seqüências é feito, seguindo a ordem dos ramos na árvore-guia. As seqüências são alinhadas das extremidades até a raiz. Este alinhamento é feito de acordo com as relações filogenéticas encontradas na árvore-guia.

ClustalW

ClustalW

ClustalW

ClustalX – uma interface Windows para o ClustalW