Idéias, Possíveis projetos de Pós-Doutoramento, Brain Storm Jorge Mondego Dezembro/2005

Patógenos BiotróficosPatógenos Necrotróficos Crinipellis perniciosa JA Via dos octadecanóides COI1 AtMYC2 ERF1 WRKY70 SA NPR1 Ca2+/NO/ROS HR (PCD) Genes R Resposta a patógenos via SA p.e – PR-1, PR-2, PR-5, PR-7 Resposta a patógenos via JA/etileno p.e – defensina PDF1.2, etc. Resposta a ferida via JA/ABA p.e – VSP, PIN, LAP, LOX, etc ABA AOX, Catalase NEP (oxalato decarboxilase ?) Oxalato de cálcio H2O2 PCD Ca2+ Etileno bZIP/TGA Fatores responsivos a Auxina X Ferida Figueira et al., 2005 QTL

- Idéias para futuros projetos - “Possível” projeto de pós-doutoramento - Sugestões, opiniões - Brain Storm sobre projetos em andamento

Caracterização da expressão gênica de Crinipellis perniciosa em diferentes condições de crescimento Análise das bibliotecas de subtração – complexidade, redundância, comparação dos genes em cada biblioteca Análise dos microarranjos – Hibridação nos slides, coleta e análise de dados (Ludwig ?)

Caracterização da maquinaria de SiRNA em Crinipellis perniciosa Silenciamento de RNA - PTGS, Quelling, RNAinterference – dsRNA MicroRNA – Regulação de genes endógenos – desenvolvimento e diferenciação celular - Alguns No Hits são MicroRNAs - Existem microRNAs em fungos ? (Kadotani et al., 2004) Formação de heterocromatina e repressão de elementos transponíveis (TGS) – S. pombe e plantas Idéia – vasculhar genes envolvidos com siRNA e regulação gênica via RNA no banco de dados CP e cacau -Possíveis colaborações – Tiago Pereira (FCM), Fabio Nogueira (CSHL)

Caracterização de proteínas extracelulares secretadas na fase biotrófica de Crinipellis perniciosa com atividade de protease e inibidor de protease Biotrofia – Suprimir defesas do vegetal (Grupo de PTNS que ajudam na infecção e na supressão das defesas do hospedeiro). Como um patógeno consegue viver no apolasto ? – poucos nutrientes, ambiente inóspito (proteínas de defesa vegetal – quitinase, glucanase, proteases - PR7) Expressão de proteínas supressoras de defesa: -Anti-oxidação e turnover metabólico – AOX, p.e -Proteases – Clivam proteínas de defesa vegetal -Inibidores de protease (IPs) – Inibem proteases do hospedeiro - Phytophthora spp., Cladosporum fulvum

Proteínas Kazal Tian et al., 2004 e Identificado um IP serínico da classe Kazal que interage diretamente com uma protease serínica do tipo subtilisina vegetal durante a infestação por Phytophthora infestans; 2- Asp no resíduo P1. Seria Epi1 um inibidor de Saspase (PCD)? Supressão de morte celular programada da planta manteria célula viva, propiciando o desenvolvimento do oomiceto biotrófico na planta. A priori – Clonar e caracterizar genes de CP que codificam proteínas Kazal Não achei proteínas Kazal no banco de dados CP

Caracterização de proteínas extracelulares secretadas na fase biotrófica de Crinipellis perniciosa com atividade de protease e inibidor de protease Análise das proteínas presentes no meio extracelular de CP na fase biotrófica PAGE – Ensaio enzimático proteolítico e de inibição de proteólise Análise da(s) banda(s) – 2D, MS/MS, seqüenciamento N-terminal Possíveis colaboradores: UESC, Marcos Eberlin (Lab Thomson), Fabio Gozzo (LNLS), Camilo (LAQUIP), Maria Tanaka (UNIFESP) Clonagem do geneExpressão da proteínaImobilização em coluna Fluido apoplástico cacauPull Down Seqüenciamento N-terminal MS/MS

Caracterização da proteína do tipo taumatina de Crinipellis perniciosa Taumatina-like (PR-5): Proteínas de plantas que desestabilizam membranas fúngicas, se ligam e hidrolizam β-1,3-glucanas fúngicas Encontradas em Schistocerca gregaria, C. elegans, nos basidiomicetos Cryptococcus neoformans, Pleurotus eryngii e nos conídios de Aspergillus nidulans Osmotina – PR-5 de tabaco. Induz PCD em S. cerevisae. Se liga a receptor de adiponectina de mamíferos Existem proteínas similares a receptores de adiponectina em plantas Qual a “função” de uma taumatina em um fungo fitopatogênico? -Evitar colonização de outros fungos na vassoura ??? -Estimular PCD em plantas ??????

Caracterização da proteína do tipo taumatina de Crinipellis perniciosa Clonagem (RACE-PCR) Expressão da proteína Testes antifúngicos Testes in planta Anticorpos (Luiz Perone, Profa Dagmar) Transformação em Arabidopsis Sistema de expressão induzível (GR-dexametasona) Possível colaborador: Michel Vincentz Proteína “complicada” – pontes disulfeto Tentar vários plasmídeos e hospedeiros (E. coli, Aspergillus, Pichia, Baculo) Expressão em CP (B/T) Expressão durante infestação

Medição de fitohormônios e enzimas durante a infestação de Crinipellis perniciosa Fitohormônios regulam mecanismos de desenvolvimento e defesa Aumento da auxina (?) – Hipertrofia (alongamento celular, retardo da abscisão foliar, altos níveis induzem produção de etileno, formação de frutos partenocárpicos) Grãos de amido “somem” durante infestação – Medição de alfa-amilase - Medir Ácido salicílico (SA), Ácido jasmônico (JA/MeJA) e octadeconóides (OPDA) Ácido abscísico (ABA), Auxinas, Citocininas, Brassinoesteróides Colaborador: Paulo Mazzafera

Fisiologia, anatomia e bioquímica do roletamento Roletamento – Corte ao longo do tronco – rompimento do floema – reconstituição após 40 dias. Antecipação do florescimento (2 meses após corte) Sinal “deve ser” transmitido do sítio de ferimento até “gemas florais” Sinal interno e/ou externo (?) – Ferimento induz liberação de voláteis (terpenóides, hexenos, etileno, MeJA). Alguns artigos indicam que MeJA e etileno regulam positivamento o desenvolvimento floral Idéia 1 – Sinal externo Medição dos voláteis liberados após ferimento, avaliar adiantamento da floração por ferimento, verificar se voláteis induzem floração em plantas vizinhas (espécie –específico ?) Idéia 2 – Sinal interno (?) Sistemina Receptor de regulação floral Colaborador: Paulo Mazzafera, Marcelo Dornelas, Michel Vincentz

7 - Por que Crinipellis infecta somente tecidos meristemáticos? X Quimiotaxia ? Proteínas receptoras específicas de tecidos meristemáticos ?

8 – Brain Storm Bibliotecas AOX NEP