T/NK-cell Progenitor Thymus T-cell Progenitor NK-cell Progenitor HEMATOPOIESE Stem cell CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-MCFU-G B-cell Progenitor CMP CFU-GEMM.

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1 T/NK-cell Progenitor Thymus T-cell Progenitor NK-cell Progenitor HEMATOPOIESE Stem cell CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-MCFU-G B-cell Progenitor CMP CFU-GEMM CLP LINFÓCITOS MADURO c. visível ERITRGRANMONOPLT IMATURO Compartimento invisível BLASTO

2 Esfregaço de MEDULA OSSEA

3 LEUCEMIA PROMIELOCITICA AGUDA CITOGENÉTICA Observação de 1 a 100 células FISH Observação de 1 a 100 células CITOMETRIA DE FLUXO 100 000 células/min CAPACIDADE DE ANÁLISE - PATOLOGIA

4 DEFENIÇÕES Citometria de Fluxo - Flow Cytometry –Mede as propriedades das células em suspensão Células em suspensão fluem em “fila-única” através dum espaço confinado onde estas são exposta a um feixe de luz e emitem fluorescência. Esta é colectada, filtrada e convertida em valores digitalizados que são guardados num computador.Líquido Optica Electronica Flow Sorting –Separa as células (Sorting) baseando-se nas suas propriedades –Também designado Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)

5 1° laser – 15mW 488nm air-cooled argon-ion laser 2° laser – 635nm red diode laser Becton Dickinson FACSCalibur Becton Dickinson FACSCalibur 4-color analyser...Equipado com 2 lasers...e 4 detectores de fluorescência FL1 – 530 ± 15nm FL2 – 585 ± 21nm FL3 – 670+nm FL4 – 661 ± 8nm

6 Forward light scatter Side light scatter Lixo Fluxo Laminar: o líquido da amostra passa pelo tubo central e não se mistura com solução tampão CITOMETRO - ESQUEMA Laser Feixe laser Nozzle (50-300 µm) Amostra em suspensão Regulador de amostra Sheath fluid Bomba de ar Regulação da pressão de ar

7 Emissão detectada a 180ºC (frente) em relação ao eixo do laser Emissão detectada a 90ºC (lateral) em relação ao eixo do laser Forma e homogeniedade da célula FSC Laser ssc Tamanho da célula (ou particula) FSC Laser

8 Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro? Granulócitos Monócitos Linfócitos FSC SSC 90 Degree Scatter 0 200 400 600 8001000 Lymphocytes Monocytes Neutrophils Side Scatter Projection 8 15 20 30 40 50 100 200 1000 Scale Purdue University Cytometry Laboratories

9 T/NK-cell Progenitor Thymus T-cell Progenitor NK-cell Progenitor LINFÓCITOS B-cell Progenitor IMATURO Compartimento invisível Stem cell CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-MCFU-G CMP CFU- GEMM CLP BLASTO Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro?

10 CD45 CD34 CD38 Fresh CB CD34+ cells 96.5% 98% CD34 + CD38 + Progenitores hematopoiéticos Stem cell CFU-Meg BFU-E CFU-E CFU-GM CFU-MCFU-G CMP CFU- GEMM CLP CD10 CD19 25.2% DIFERENCIAÇÃO CELULAR Como se vêm as células hematopoiéticas no citometro? CD45 CD34 Diferenciação de células B FluorochromeEmission FITC525nm PE575nm PE-TexasRed613nm GFP515nm Propidium Iodide600nm

11 Análise DNA CICLO CELULAR PI Fluorescence 0 200 400 600 8001000 DNA content 0 200 400 600 8001000 G0G0G0G0 G1G1G1G1 s G2G2G2G2M CountCount 2N 4N

12 Ciclo celular – Detecção de Fase S J.W. Gray, F. Dolbeare & M.G. Pallavicini - MLM Chapt. 23 Incorporação de um nucleótido marcado - Bromodeoxiuridina (BrdU) (análogo da timidina) BrdU PI

13 ALTERAÇÕES FUNCIONAIS/BIOQUIMICAS  Aumento dos niveis livres de cálcio  Interações bcl2/BAX  Desidratação celular  Perda dos potênciais de membrana mitocôndriais  Proteolise  Externalização fosfatidilserina  Proteolise Lamin B  Desnaturação DNA  Clivagem 50-300kb  Clivagem intranucleosomal  cross-linking de proteínas ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS  Célula “encolhe”  A forma da célula muda  Condensação do citoplasma  Alterações no envelope nuclear  Fagmentação nuclear  Perda de estruturas de superfície  Corpos apoptóticos  Descolamento celular  Fagocitose dos “debris” celulares APOPTOSE – Morte celular programada

14 DETECÇÃO de Sub G1 Células apoptóticas começam a ter menos DNA que células normais em G1 PI Fluorescence 0 200 400 600 8001000 2N 4N Indução de morte celular com adição de substância tóxica Quantificação de DNA

15 Residuos de Fosfatidilserina (PS) são translocados para a face externa: Sinal para as células vizinhas iniciarem a fagocitose Detecção das fases iniciais de apoptose

16 As células podem ser separadas até 25,000 células/segundo em ambiente esterelizado (importante para estudos in vitro ou in vivo das células separadas) 488 nm laser + - Fluorescence Activated Cell Sorting Placas carregadas Células separadas e recolhidas uma a uma FSC Fluorescence detector Adaptado de Purdue University Cytometry Laboratories