Bioquímica da fermentação etanólica

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1 Bioquímica da fermentação etanólica
Cauré portugal

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3 1. Kloeckera, Hanseniaspora, Candida
2. Pichia, Metschnikowia 3. Saccharomyces cerevisiae Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosacchaomyces, Zygosaccharomyces, Brettanomyces

4 Anaeróbios facultativos Anaeróbios obrigatórios
Organismos aeróbios que conservaram a capacidade de recorrer à fermentação para produzir energia, nos curtos períodos em que o oxigênio não se encontra disponível. Anaeróbios obrigatórios São seres que têm na fermentação a sua única fonte de obtenção de energia.

5 Adaptação às condições
Influência direta: temperatura; concentrações de amônia, aminoácidos e outros nutrientes; presença de oxigênio Falta de nutrientes; acúmulo de etanol

6 FASE LAG Aclimatação: absorção de oxigênio, minerais, vitaminas (riboflavina, inositol, biotina) e aminoácidos (N)*. Oxigênio: produção de esteróis (permeabilidade da membrana). Baixa atividade celular.

7 FASE DE CRESCIMENTO EXPONENCIAL
Consumo de açúcares, produção de CO2, etanol e compostos aromáticos. Fase de crescimento celular: utilização dos açúcares mais simples.

8 FASE ESTACIONÁRIA Termina a produção da maioria dos compostos.
Reabsorção de alguns metabólitos produzidos durante a fermentação. Início da floculação das células

9 FASE DE MORTE CELULAR Autólise (destilados e vinhos espumantes)
Degradação por enzimas endógenas com liberação de diversos componentes (peptídeos, aminoácidos, ácidos graxos, nucleotídeos, nucleosídeos)

10 Metabolismo celular OXIDAÇAO REDUÇAO
CATABOLISMO ANABOLISMO Reações metabólicas em que os compostos orgânicos são degradados em moléculas mais simples, ocorrendo liberação de energia. Reações metabólicas em que ocorre formação de moléculas mais complexas a partir de moléculas mais simples, ocorrendo consumo de energia. É o conjunto de reações químicas essenciais à vida realizadas pelas células de todos os seres vivos. OXIDAÇAO REDUÇAO

11 Transferência de energia contida nos compostos orgânicos para moléculas de ATP.
Nestas vias, intervêm compostos (como o NAD+) que transportam os prótons (H+) e elétrons (e-) do hidrogênio, desde o substrato até um aceptor final. NAD e H NADH + H+ oxidação redução (forma oxidada) (forma reduzida) Reaçoes catabólicas Respiração Aeróbia Respiração Anaeróbia Fermentação Aceptor final de elétrons: Oxigênio Outras moléculas inorgânicas Outras moléculas orgânicas

12 Fermentação e Respiração
São duas vias catabólicas responsáveis pela transferência de energia de compostos orgânicos (glicose) para moléculas de ATP. Em ambos os processos estão implicadas: Reações de descarboxilação (perda de CO2) Reações de fosforilação (transferência de Pi) Transferências de energia do tipo oxidação – redução.

13 LEVEDURAS: microorganismos anaeróbicos facultativos (capazes de metabolizar açúcares em ausência e em presença de oxigênio) Utilização das reservas de glicogênio e oxigênio disponível no meio para revitalizar a membrana (permeabilidade e transferência). Consumo de oxigênio e de açúcares e nutrientes (difusão facilitada e/ou transporte ativo). Consumo de açúcares na seguinte ordem: Glicose* Frutose Sacarose Maltose Maltotriose Consumo de açúcares: FERMENTAÇÃO RESPIRAÇÃO

14 Glicose + 2 ADP + 2 NAD+ + 2 Pi 2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+
GLICÓLISE Glicose + 2 ADP + 2 NAD+ + 2 Pi 2 Piruvato + 2 ATP + 2 NADH + 2 H+ MITOCÔNDRIA: Respiração aeróbica Presença de O2 Libera CO2 e H2O 36-38 ATP CITOSSOL: Fermentaçao Ausência de O2 Acetaldeído > Etanol 2 ATP Efeito “Crabtree” Presença de O2 Elevadas concentrações de glicose Produção de Etanol

15 Fosfoglicose isomerase
D-Glicose D-Frutose ATP Glicose-6-fosfato Hexoquinase ADP+Pi Fosfoglicose isomerase Frutose-6-fosfato ATP Fosfofrutoquinase Glicerol ADP+Pi Frutose-1,6-difosfato %96 Aldolase Pi Fosfato de Di-hidroxiacetona 4% Triose-fosfato isomerase Gliceraldeído-3-fosfato NAD + G3P desidrogenase NADH+H+ 1,3-difosfoglicerato 2 ADP+Pi FG quinase 2 ATP NAD (Dinucleótido de Nicotinamida-Adenina); NAD+ (FORMA REDUZIDA) GLICEROL: reduçao da DHAcetona > regenera NAD+ em ausencia de acetaldeído Piruvato (2) 3-fosfoglicerato 2 ATP 2 ADP+Pi FG mutase Piruvato quinase Enolase Fosfoenolpiruvato (PEP) 2-fosfoglicerato H2O glicólise

16 PRODUÇÃO DE ENERGIA PREPARAÇÃO Fosforilação da glicose
Isomerização da glicose Fosforilação da frutose-6-fosfato Clivagem da frutose-1,6-difosfato Interconversão das trioses Oxidação do gliceraldeído-3-fosfato em 1,3-difosfoglicerato Transferência de Pi para o ADP Conversão do 3-fosfoglicerato em 2-fosfoglicerato Desidratação do 2-PG para Fosfoenolpiruvato Transferência do grupo-P para o ADP

17 Glicólise

18 Piruvato desidrogenase
HS CoA CO2 Piruvato Piruvato desidrogenase Acetil CoA NAD + NADH+H+ CO2 Ciclo de Krebs NADH, FADH2 Coenzimas reduzidas Coenzimas oxidadas 38 ATP CADEIA RESPIRATÓRIA KREBS=CICLO DOS ÁCIDOS TRICARBOXILICOS (ocorre na matriz mitocondrial dos eucar. e no citopl. d)os procar.) Acetil CoA:  degradação de carboidratos, ácidos graxos e aminoácidos a duas moléculas de CO2. O2 H2O RESPIRAÇÃO

19 Piruvato descarboxilase
D-Glicose D-Frutose Regeneração de NAD+ 2 ATP 2 ADP+ 2 Pi Frutose-1,6-difosfato Fosfato de Di-hidroxiacetona %96 4% Gliceraldeído-3-fosfato G3P desidrogenase NAD+ Etanol Etanol 1,3-difosfoglicerato NADH + H+ Alcool desidrogenase 4 ADP + 4 Pi Piruvato descarboxilase Acetaldeído 4 ATP Piruvato CO2 FERMENTAÇAO

20 Produtos da Fermentação Alcoólica

21 Principais metabólicos sensorialmente ativos produzidos durante a fermentação alcoólica
H2S Diacetil Glicerol Acetaldeído Cetoácidos Aldeídos Etanol Alcoóis superiores Ácido acético Monoterpenos Ácido succínico Ácidos graxos Swiegers et al Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavour. Australian J Grape Wine Res, 11(2): Ésteres

22 Principais compostos aromáticos
álcoois superiores Ácidos orgânicos Origem: início da fOH via degradativa: descarboxilação e desaminação de aminoácidos presentes no meio; via biosintética (após depleção do meio) Fatores: altas temperaturas, alta concentração de inóculo, aeração. Origem: vias metabólicas intermediárias (acetato*, malato, succinato) via biosintética de ácidos graxos Fatores: adição de alcalinos; concentração de P, Mg e biotina.

23 Compostos carbonílicos
Ésteres Compostos carbonílicos Origem: final da fOH reações entre álcoois e acil-CoA diretamente proporcional à produção de álcoois Principal: acetato de etila (acetil-CoA + etanol) Fatores: anaerobiose; restrição de crescimento (falta de aeração e nitrogênio) Diacetilo*, aldeídos** (acetaldeído) Origem: descarboxilação oxidativa de hidroxiácidos*; intermediários na produção de álcoois superiores Metabolizados pela levedura ao final da fOH. Fatores: cinética e eficiência da fermentação Anaerobiose: ácidos graxos insaturados e esteróis não são produzidos > ácidos orgânicos ficam disponíveis para conversão em ésteres (excretados)

24 Compostos sulfurosos Origem: matéria-prima; metabolismo do enxofre; enxofre inorgânico; suplementação. Sulfeto de hidrogênio (H2S): quebra de metionina e cisteína (autólise ou turnover proteico)

25 Regulação entre respiração e fermentação
Alta demanda de ADP na mitocôndria (substrato para oxidação fosforilativa) Consumo de açúcares pelas leveduras Biomassa Liberação de CO2 O2 Carência de ADP e Pi no citoplasma Cinética da fermentação Consumo de açúcares Produção de etanol Deslocamento do O2 disponível Redução do transporte de açúcares Condições semi-anaeróbicas Inibição da fermentação Efeito Pasteur

26 Regulação entre respiração e fermentação
Efeito pasteur Efeito crabtree ou pasteur-negativo Sob condições anaeróbicas, a cinética da glicólise é maior do que em aerobiose, ou alternativamente, a fermentação é suprimida em presença de oxigênio. Condições: baixas concentrações de glicose ou limitações de nutrientes. Mesmo sob condições aeróbicas, a fermentação predomina sobre a respiração (NADH gerado na glicólise é oxidado pela via fermentativa) Condições: altas concentrações de glicose ou limitações de nutrientes.

27 Regulação entre respiração e fermentação
Efeito custer Inibição transitória da fermentação em condições anaerobióticas. Oxigênio estimula a produção de etanol devido â ausência de NAD+ intracelular devido à secreção de acetato pela célula Condições: pequenas concentrações de oxigênio ou aceptores orgânicos de hidrogênio (acetoína) > atuam como aceptor exógeno de H para reestabelecer o equilíbrio redox e regenerar NAD+

28 Outros tipos de fermentação
Fermentação gliceropirúvica Presença de sulfito (SO32− ) no meio, que se combina com acetaldeído, impedindo regeneraçao de NAD+ pela alcool-desidrogenase. Síntese intensa de proteínas, lipídios, nucleotídeos, etc. (início da fOH) = alto requerimento de piruvato como substrato. Levedura oxida NADH a partir do fosfato de dihidroxiacetona. Ocorre consumo de ATP (!), mas que é necessário para recuperar o balanço redox intracelular.

29 Outros tipos de fermentação
“Fermentação maloláctica” Ocorre posteriormente à fermentaçao alcoólica em vinhos. Bactérias capazes de resistir ao ambiente de baixo pH e elevado teor alcoólico. Oenococcus oeni.

30 Parada e lentidão de fermentação
Elevadas concentrações de açúcares Excessiva concentração de etanol 2. Extremos de temperatura Modificações na fluidez da membrana. 3. Anaerobiose Oxigênio é necessário para sintetizar ergosterol: crescimento e adaptação ao meio. 4. Deficiência de nutrientes

31 Presença de substâncias antifúngicas
Resíduos de pesticidas. Presença de ácidos graxos de cadeia média (6 a 10 C) Afetam a viabilidade celular (baixas temperaturas e ausencia de aeraçao) Antagonismo entre microorganismos Competição por nutrientes.