BIOLOGIA 15. Citologia.

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1 BIOLOGIA 15. Citologia

2 Índice Introdução Microscópio Óptico Pequeno Histórico
Vírus Técnicas de Observação em Citologia Tipos de Microscópios Unidades de Medida em Microscopia Aumento x Resolução Microscópio Óptico Técnicas de preparação de amostras p/ microscópipos ópticos Microscópio Eletrônico

3 Introdução A Citologia (do grego, kytos = célula e logos = estudo) é a especialização da Biologia que estuda as células. A visão humana só pode ter acesso ao universo celular quando auxiliada pelos microscópios, pois as células geralmente têm um tamanho tão pequeno que não podem ser observadas diretamente. Assim, a história da Citologia só teve origem após o aparecimento dos primeiros microscópios e sua utilização para a observação de seres vivos.

4 Antoine van Leeuwenhoek (1632-1723)
Pequeno histórico No fim do século XVI, os irmãos holandeses Hans e Zacharias Janssen montaram o primeiro microscópio de que se tem notícia adaptando duas lentes de aumento às extremidades opostas de um tubo. Mais tarde, o também holandês Antoine van Leeuwenhoek ( ) usou um microscópio de uma única lente com capacidade de aumento de 300 vezes para observar material biológico. Antoine van Leeuwenhoek ( )

5 Microscópio de Leeuwenhoek
Pequeno histórico Com essa lente de aumento, Leeuwenhoek observou seres microscópicos, como bactérias e protozoários, além de observar alguns tipos de células do corpo humano, como glóbulos vermelhos do sangue e espermatozoides do sêmen. Essas observações provocaram um interesse muito grande dos pesquisadores em relação ao mundo microscópico dos seres vivos. Microscópio de Leeuwenhoek

6 Pequeno histórico Na Inglaterra, o físico Robert Hooke ( ) montou um microscópio de duas lentes (chamado hoje em dia de microscópio composto). Com esse aparelho óptico, Hooke fez diversas observações em tecidos vegetais, entre os quais uma fatia de cortiça, constatando que ela era formada por pequenos compartimentos fechados e repletos de ar que foram denominados células (do latim, cellula = diminutivo de cella, que significa compartimento). Legenda da figura: O microscópio de Robert Hooke e o aparelho usado para iluminação das amostras. Em destaque no círculo, um desenho feito por ele a partir de observação de cortiça mostrando um tecido composto de muitas células. Hooke não poderia saber, mas estava observando um tecido vegetal formado por células mortas.

7 Pequeno histórico Já em 1831, o botânico Robert Brown ( ) descreveu o que chamou de núcleo como uma estrutura comum a todas as células vegetais. Logo essa estrutura também estava descrita em células animais. A descrição do conteúdo interno das células se completaria com a observação de que havia um gel interno que logo foi chamado de citoplasma. Assim, no final da década de 1830, as células eram descritas como dotadas de três estruturas básicas: membrana (envoltórios celulares), citoplasma e núcleo. Com o tempo, os cientistas perceberam que as células eram unidades encontradas em praticamente todos os seres vivos.

8 Pequeno histórico Em 1838, dois pesquisadores alemães firmaram a hipótese de que as células são as unidades fundamentais da vida. Mathias Jakob Schleiden ( ), que era botânico, e Theodor Schwann ( ), médico e zoólogo, acumularam observações ao microscópio de muitos tecidos vegetais e animais, sempre encontrando os pequenos compartimentos fechados: as células. Ilustrações feitas por M. Schleiden sobre observações e estruturas vegetais e fungos e suas células.

9 Pequeno histórico Embora não apresentassem exatamente o mesmo padrão estrutural — por exemplo, as células vegetais eram dotadas de um envoltório que aparecia nitidamente aos microscópios de então, enquanto as células animais não apresentavam um envoltório nítido — os dois pesquisadores reconheceram que podiam estar diante da unidade básica da vida e propuseram para a comunidade científica que a vida se estrutura a partir das células. A proposição de Schleiden e Schwann foi amplamente aceita pelos cientistas da época e as pesquisas em Citologia progrediram rapidamente, produzindo descobertas que confirmavam essa noção.

10 Pequeno histórico O médico fisiologista Rudolph Virchow ( ) reuniu observações de vários pesquisadores e afirmou que células são originadas de outras células preexistentes. Sua hipótese ganhou notoriedade por meio da frase em latim “Omnis cellula e cellula”, que significa que “toda célula provém de outra célula”. Essa ideia foi confirmada em 1878 pelo biólogo Walther Flemming ( ), que observou e descreveu o fenômeno de divisão celular conhecido como mitose, em que uma célula se divide em duas novas células. Desenhos feitos por Flemming, em 1882, mostrados em seu livro Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung.

11 Pequeno histórico Logo em seguida, novas observações mostraram que a reprodução de plantas e animais era, muitas vezes, consequência da fusão de células especializadas: os gametas. Um gameta masculino se une a um feminino, formando uma célula completa, chamada mais tarde de zigoto ou célula ovo. Mitoses sucessivas em que o zigoto se dividia em duas novas células, essas em duas cada uma, e assim sucessivamente, originavam um novo indivíduo.

12 Pequeno histórico Essas descobertas foram fantasticamente importantes, pois, pela primeira vez, os fenômenos básicos da vida eram alcançados e o mundo dos seres vivos poderia finalmente fazer um nítido sentido, ou seja, ter sua lógica mais fundamental esclarecida por meio de fenômenos observáveis e deduções racionais. A teoria celular se completou no final do século XIX. Em resumo, ela dizia que todos os seres vivos eram formados por uma ou mais células e que essas se originam de células preexistentes segundo processos de divisão celular. Assim, a célula passou a ser considerada a fonte de toda a vida, a estrutura a partir da qual todos os seres vivos são construídos e o local em que ocorrem os fenômenos mais básicos e fundamentais da vida.

13 Pequeno histórico A noção de que todas as partes de um organismo pluricelular são conjuntos organizados de células especializadas ganhava adeptos mesmo entre os médicos, muitos dos quais já assumiam que todas as doenças eram ligadas a interferências no funcionamento celular. No final de século XIX, a maior ambição dos biólogos passou a ser a descrição de quais eram e como funcionavam as partes de uma célula viva.

14 Vírus Em 1892, o biólogo russo Dimitri Ivanowsky descobriu que uma doença que afetava as folhas de plantas de tabaco era causada por um microrganismo tão pequeno que não poderia ser visto ao microscópio: um vírus. Mais tarde, na década de 1950, os vírus foram descritos graças à microscopia eletrônica e evidenciou-se que eram estruturalmente muito simples, formados fundamentalmente de proteínas e ácidos nucleicos (DNA ou RNA), moléculas características das células, mas que nos vírus não chegavam a se organizar num padrão celular. Assim, o vírus pode ser descrito como uma partícula de moléculas orgânicas que não se organiza suficientemente para chegar a ter metabolismo próprio. Entretanto, essas partículas têm capacidade de invadir células vivas e estabelecer um domínio bioquímico sobre as estruturas das células hospedeiras.

15 Vírus Ilustração mostrando alguns tipos de vírus e seus componentes fundamentais: uma cápsula proteica (capsídeo) envolvendo moléculas de ácidos nucleicos (DNA, RNA). Em seu interior, os vírus se multiplicam e se alastram, invadindo novas células com suas sucessivas gerações. Embora alguns cientistas não considerem os vírus como seres vivos e sim como complexos bioquímicos dotados de capacidade de replicação, essa mesma descrição pode também ser usada para as células e essa discussão já causou bastante polêmica. De qualquer forma, embora os vírus sejam acelulares, sua existência depende das células.

16 Técnicas de observação em citologia
Como já vimos, o desenvolvimento do microscópio foi vital para a evolução da Citologia, já que a maioria das células é muito pequena. Existem exceções, células macroscópicas podem ser encontradas. Por exemplo, a alga unicelular chamada acetabulária, vista na imagem ao lado, pode chegar a medir entre 5 e 8 cm de comprimento. Além das observações com microscópios, os biólogos também podem realizar observações indiretas, que consistem em testar estruturas quanto a seu comportamento em situações específicas e deduzir características estruturais e de composição química a partir dos resultados dos testes.

17 Técnicas de observação em citologia
Esse tipo de observação pode ser usado em situações em que a observação direta (visualização com ou sem microscópio) é dificultosa ou para complementar a observação direta com mais informações. Com dados obtidos a partir de observações diretas e indiretas, pode-se montar um modelo do objeto. Evidentemente, esse modelo tem caráter precário, ou seja, pode ser modificado ao longo do tempo por novos dados obtidos por meio de novas técnicas de observação direta e indireta. Há muitos exemplos da sucessão cronológica de modelos científicos para um mesmo tema. Em Citologia, encontramos os sucessivos modelos sobre o arranjo de moléculas de proteínas e lipídios na estrutura das membranas celulares.

18 Técnicas de observação em citologia
Veremos que as informações visuais obtidas por meio de microscópios são escassas devido às dimensões extremamente pequenas das membranas. Ao longo do tempo, entretanto, com o surgimento do microscópio eletrônico e de novas técnicas de observação indireta, os modelos foram se sucedendo e se tornando cada vez mais completos, permitindo previsões progressivamente mais detalhadas e precisas sobre as reações das membranas celulares a situações específicas, sua composição química e funções.

19 Microscópio eletrônico
Tipos de Microscópios Atualmente, podemos dividir os inúmeros tipos de microscópios existentes em dois grandes grupos: os microscópios ópticos e os eletrônicos. Os microscópios ópticos atuais são derivados dos primeiros microscópios construídos no século XVI. Hoje em dia, mais sofisticados, podem fornecer imagens com aumentos de até 1500 vezes com razoável nitidez. Os microscópios eletrônicos são aparelhos que fornecem uma espécie de imagem eletrônica do objeto. Têm uma capacidade muito maior de aumento ( vezes ou mais) e captam detalhes estruturais muito mais sutis, ou seja, têm maior capacidade de resolução. Microscópio eletrônico

20 Unidades de Medida em Microscopia
O universo microscópico necessita de unidades de medida adequadas para objetos muito pequenos. As principais são: micrômetro (μm): corresponde a 1/ de um metro. Por exemplo, a medida média das células animais é da ordem de 10 μm; já as bactérias costumam medir entre 1 e 2 μm. nanômetro (nm): corresponde a 1/ de um metro, ou seja, 1/1.000 de micrômetro. A maioria dos componentes internos da célula mede algumas poucas dezenas de nanômetros. As moléculas encontradas nas células, como proteínas e DNA, podem ter suas dimensões descritas em nm. Uma molécula de água mede cerca de 0,3 nm.

21 Unidades de Medida em Microscopia
Angstron (Å): corresponde a 1/ de metro, ou seja, 1/10 de nanômetro. Unidade que aos poucos caiu em desuso na Biologia em favor do nm. picômetro (pm): corresponde a 1/ de metro, ou 1/1.000 de nm. Não é uma unidade muito utilizada em Biologia. O núcleo de um átomo mede em torno de 0,01 pm.

22 Aumento x Resolução Tanto os microscópios ópticos como os eletrônicos têm sua eficiência medida a partir de dois parâmetros fundamentais: capacidade de aumento: diz respeito a quantas vezes a imagem do objeto pode ser ampliada. Se o aumento é de duas vezes, significa que a imagem produzida terá o dobro das dimensões originais do objeto. Legenda da figura à esquerda: S indica estômatos; E indica células da epiderme (tecido de revestimento externo da folha), V são os feixes de vasos de transporte, B são células que revestem o feixe de vasos e M é o tecido que preenche internamente a folha chamado mesófilo. Legenda da figura a direita: VA é um grande vacúolo de uma célula de revestimento de um feixe de vasos. MI é a mitocôndria; P é o peroxissomo; BC são os cloroplastos; M e MC são cloroplastos de células vizinhas e W é um pequeno trecho de parede celular. Micrografia (fotografia tirada ao microscópio) de um corte transversal de folha de milho. Aumento de 100 x. Eletromicrografia (imagem obtida com microscópio eletrônico) de células de folha de milho com aumento de x.

23 Aumento x Resolução Resolução: é a capacidade de o aparelho mostrar os detalhes do objeto com nitidez. Pode ser definida mais precisamente como a capacidade de distinguir pontos separados. Se dois pontos separados por uma distância de 0,002 mm são mostrados como um só ponto, pode-se dizer que o aparelho não mostrou uma imagem plenamente fiel do objeto. Costuma-se dizer, nesses casos, que o aparelho não resolveu a imagem desses dois pontos. O olho humano, por exemplo, possui uma capacidade de resolução da ordem de 0,1 mm, ou seja, nosso olho é capaz de resolver, isto é, distinguir pontos que estejam, no mínimo, a um décimo de milímetro de distância. Esse parâmetro pode ser chamado de limite de resolução. Assim, o limite de resolução do olho humano é de 0,1 mm.

24 Microscópio Óptico A configuração básica dos microscópios atuais não difere da dos microscópios compostos que Hooke e Leeuwenhoek usavam no século XVII. Seus componentes fundamentais são: canhão: tubo que suporta as lentes em suas extremidades; lente ocular: lente que fica mais próxima dos olhos do observador. Geralmente são lentes de pouca capacidade de ampliação; lente objetiva: lentes que ficam próximas ao objeto. São também chamadas lentes de potência por terem maior capacidade de aumento;

25 Microscópio Óptico platina: base de suporte para o objeto;
lente condensadora: também chamada simplesmente condensador. Trata-se de uma ou mais lentes que concentram os raios de luz melhorando a iluminação do objeto; fonte de luz: os microscópios atuais podem usar luz natural refletida por um espelho ou luz artificial produzida por lâmpadas especiais; revólver: a maioria dos microscópios atuais apresenta várias lentes objetivas (geralmente quatro) com aumentos diferentes que podem ser comutadas por meio do revólver.

26 Microscópio Óptico . Bons microscópios ópticos conseguem aumentos de até 1500 vezes. O aumento da imagem pode ser calculado multiplicando-se o aumento da lente ocular pelo aumento da lente objetiva. Por exemplo, se a ocular tem um aumento de 10 vezes e a objetiva, de 150, teremos um aumento total de 1500 vezes. Isso quer dizer que, se focarmos um objeto que mede 1 μm, a imagem produzida terá 1500 μm, ou seja, 1,5 mm. O limite de resolução dos bons aparelhos é da ordem de 0,25 μm, 400 vezes maior que o limite de resolução do olho humano

27 Técnicas de Preparação de Amostras para Microscópios Ópticos
Para uma boa observação de material biológico ao microscópio, é necessário que ele seja convenientemente preparado. As técnicas de preparação são variadas, de acordo com o tipo de material e de detalhes que se deseja observar. Entretanto, podemos fazer um apanhado das técnicas fundamentais empregadas principalmente em Citologia. Amostras de células podem ser observadas ainda vivas ou mortas.

28 Técnicas de Preparação de Amostras para Microscópios Ópticos
As preparações com amostras vivas são chamadas de observações vitais ou a fresco. Nesse caso, as células são mantidas vivas tanto tempo quanto possível. Esse tipo de observação permite o exame de atividades celulares, tais como uma ameba alimentando-se por meio de um processo chamado fagocitose, processos de locomoção celular, como o deslocamento de espermatozoides por meio de seus flagelos, fluxos internos de citoplasma, como os encontrados em muitas células vegetais etc. Já as amostras mortas são chamadas fixadas e permitem observações mais detalhadas de partes específicas das células e seus detalhes estruturais.

29 As principais etapas de preparação
Corte As amostras devem ser atravessadas pela luz quando expostas ao microscópio. Para tanto, é necessário que elas sejam finas o suficiente para que a luz possa atravessá-las. Além disso, uma amostra mais espessa de tecido poderá mostrar uma imagem com sobreposição de várias camadas de células, provocando dificuldades para que o observador possa interpretar precisamente os seus elementos. Tecidos moles, como a maioria dos tecidos animais, exigem um enrijecimento para que se possa cortá-lo sem danificar gravemente a estrutura original. Para isso, normalmente se faz a impregnação da amostra com materiais inicialmente fluidos e que depois passam por enrijecimento, como parafina ou polímeros plásticos, muito usados hoje em dia. Esse procedimento é chamado inclusão.

30 As principais etapas de preparação
Corte Para um corte suficientemente fino, costuma-se usar o micrótomo, um aparelho que consiste basicamente em duas lâminas paralelas com distância regulável que permite optar por diferentes espessuras para o corte. O micrótomo segue o mesmo princípio dos aparelhos que se encontram em padarias para cortar frios. Se, entretanto, o tecido já for naturalmente mais rígido, como a maioria dos tecidos vegetais, pode-se cortá-lo em fatias finas com aparelhos de barbear e outras lâminas finas. Micrótomo

31 As principais etapas de preparação
Fixação Consiste em um procedimento para matar rapidamente as células sem alterações em sua estrutura. Além dos processos físicos de congelamento e, em alguns casos, leve aquecimento, há também processos químicos, em que as amostras são tratadas com substâncias fixadoras como formol, álcool, ácido acético, glutaraldeído, entre outras.

32 As principais etapas de preparação
Coloração A maioria das células e suas estruturas internas são naturalmente transparentes ou apresentam cores muito tênues, o que dificulta o contraste entre as diferentes partes da amostra. Os corantes são compostos químicos coloridos, empregados justamente para contrastar e realçar os diferentes elementos de uma amostra. Para se observar os diferentes componentes de uma célula, deve-se corar cada um com uma cor. Hoje em dia, os laboratórios dispõem de vários corantes, empregados segundo as necessidades específicas de cada tipo de observação.

33 As principais etapas de preparação
Coloração O método hematoxilina-eosina, por exemplo, é muito empregado em laboratórios escolares para contrastar núcleo e citoplasma. A hematoxilina é um corante azulado que adere muito bem ao núcleo, mas tem pouca afinidade pelo citoplasma. A eosina é cor de rosa e adere ao citoplasma, mas tem pouca afinidade pelo núcleo. Nas preparações a fresco, usam-se os corantes chamados vitais, que têm baixa toxicidade, como as soluções de iodo. À esquerda células da pituitária tingidas pelo método hematoxilina-eosina. À direita o mesmo tecido tingido pelo método tricômico.

34 As principais etapas de preparação
Após essas etapas, geralmente a amostra é colocada em lâminas de vidro retangulares. Sobre a amostra deposita-se uma lamínula fina de formato quadrado para promover a aderência do material sobre a lâmina. No caso de um tecido mole com células esparsas, pode-se espalhá-lo sobre a superfície da lâmina, aplicar o corante e colocar a lamínula. Essa técnica costuma ser chamada de esfregaço e é bem adequada para amostras de sangue, mucosa bucal (parte interna da bochecha) etc. Esfregaço de sangue humano mostrando hemácias e, ao centro, um leucócito.

35 As principais etapas de preparação
Essas etapas podem ser empregadas segundo diferentes ordens, de acordo com as características de cada observação, e trazem consigo um perigo que deve ser evitado ou, quando impossível evitar por completo, minimizado: os artefatos de preparação. Esse é o nome que se costuma dar a alterações provocadas na estrutura original da amostra quando passa pelas etapas de preparação. Se não forem adequadamente prevenidas, podem deturpar a estrutura que se está observando, levando o observador a tirar conclusões imprecisas.

36 Microscópio Eletrônico
Sua capacidade de aumento é cerca de vezes ou mais. Seu limite de resolução é de 1 nm (nanômetro). Devido a essa qualidade de resolução, ele não é usado apenas em situações de grande aumento. Frequentemente imagens de 500 vezes de aumento, por exemplo, são feitas ao microscópio eletrônico para se aproveitar sua maior resolução. Fundamentalmente esse dispositivo usa feixes de elétrons no lugar de luz, o que permite a maior capacidade de aumento e limite de resolução.

37 Microscópio Eletrônico
Normalmente os microscópios eletrônicos são compostos de um tubo de aproximadamente 1 metro de altura por uns 20 a 30 cm de diâmetro. No alto do tubo há uma fonte emissora de elétrons. Esse feixe de elétrons passa no meio de um campo eletromagnético gerado por uma bobina chamada lente condensadora, já que concentra e torna mais denso o feixe de elétrons. Uma vez condensado, o feixe de elétrons passa pela amostra a ser examinada e atinge uma tela fluorescente localizada na base inferior do tubo.

38 Microscópio Eletrônico
O princípio é simples: a amostra será um obstáculo ao fluxo livre de elétrons. Quanto mais densa for uma dada região da amostra, mais elétrons serão retidos e menos luminosa será a região equivalente na tela fluorescente. Assim, a tela recebe uma imagem do contorno eletrônico com as diferentes densidades marcadas através de regiões mais claras e escuras. Após a passagem pela amostra, o feixe de elétrons ainda pode ser ampliado por duas outras bobinas, chamadas de lentes objetiva e projetora.

39 Microscópio Eletrônico
Para observações em microscópio eletrônico, a amostra não pode ser conservada viva: deve ser desidratada e conservada no vácuo. Assim, a etapa de fixação é normalmente seguida de um processo de desidratação. A coloração é um pouco diferente do processo empregado em microscopia óptica, já que a amostra não será iluminada e sim atravessada por feixe de elétrons. Dessa forma, faz-se a impregnação da preparação com matérias eletrodensas, isto é, que funcionem como bons anteparos para elétrons. Geralmente se usam sais metálicos pesados, como sais de ósmio ou prata. Quanto maior a quantidade de corante fixado numa dada região da amostra maior será a quantidade de elétrons retida, tornando o contorno equivalente na tela mais escuro.

40 Microscópio Eletrônico
As imagens obtidas por microscopia eletrônica são originalmente em preto e branco, mas podem ser coloridas posteriormente, com o uso de programas gráficos de computador. Outra etapa importante é o corte, pois o poder de penetração de feixes de elétrons é muito pequeno, o que obriga a cortes com espessuras da ordem de 0,05 μm. Para isso, usam-se micrótomos especiais (ultramicrótomos) com lâminas de vidro ou diamante. Eletromicrografia com aumento de x mostrando mais à direita, vírus bacteriófago T4, a esquerda um vírus que infecta plantas de tabaco. Preparação para microscopia eletrônica.

41 Microscópio Eletrônico
O emprego de computadores e programas especiais desenvolvidos nas últimas décadas permitiu observações com aumentos de até vezes ou mais. Com essa escala de aumento e resolução, além de técnicas sofisticadas de preparação, conseguem-se imagens de moléculas como certas proteínas e ácidos nucleicos e até outras moléculas menores.