Engenharia Genética.

Apresentação em tema: "Engenharia Genética."— Transcrição da apresentação:

1 Engenharia Genética

2 A molécula de DNA Intocável (1950-1975)
A partir de década de 70, foi possível abri-la, extrair genes, transplantá-los, multiplicá-los Conhecer doenças humanas Transformar organismos… IL 2010

3 Como encontrar um gene? Como isolá-lo?
Uso de enzimas de restrição Cortam a molécula de DNA em zonas específicas, sempre que as encontram. Presentes em bactérias, que as usam como mecanismo de defesa contra os vírus que as atacam (bacteriófagos). IL 2010

4 Enzimas de restrição Endonucleases de restrição
Enzimas presentes nas bactérias que cortam a cadeia de DNA em zonas específicas – zonas de restrição Fragmentam o DNA em fragmentos mais pequenos que contêm na extremidade a sequência reconhecida. IL 2010

5 Enzima de restrição Eco RI
Por exemplo a enzima Eco RI reconhece a sequência: 5´GAATTC3´ IL 2010

6 Enzima de restrição Eco RI
Por exemplo a enzima Eco RI reconhece a sequência: 5´GAATTC3´ fará o corte entre o nucleótido de guanina e o nucleótido de adenina em cada cadeia. IL 2010 Extremidades coesivas

7 Ligases do DNA DNA Recombinante Molécula DNA 2 Permitem catalizar as reacções em que as extremidades livres são ligadas a novas sequências de DNA (novo gene) por complementaridade de bases. Molécula DNA 1 IL 2010 Molécula DNA 3

8 Técnica do DNA recombinante
Cada fragmento de DNA, que foi separado do resto da molécula, contém um ou mais genes. Cada gene permite a síntese de uma proteína, por isso ao estudarmos o gene estamos a estudar a proteína que ele codifica. Isolando fragmentos de DNA (genes) podem transferir-se para outro organismo. Como fazer a transferência? IL 2010

9 Técnica do DNA recombinante “Vector”
É necessário usar um vector, uma entidade que possa transferir o gene do organismo (de onde foi retirado) para o organismo que o vai receber Vectores mais importantes: plasmídio* de bactérias IL 2010 Os plasmídio é uma molécula de DNA circular não ligada ao cromossoma, e que se encontra no hialoplasma das bactérias. Multiplica-se a cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.

10 Técnica do DNA recombinante “Corte e isolamento do gene”
A enzima de restrição corta o DNA do plasmídeo num ponto específico. A mesma enzima corta o DNA dador, de forma a isolar o gene que se pretende inserir no plasmídeo. IL 2010

11 Técnica do DNA recombinante “Introdução no plasmídeo”
O gene a inserir é colocado em contacto com o plasmídeo, juntamente com ligases do DNA (enzimas). O gene passa a fazer parte do plasmídeo, que possui agora um DNA recombinante IL 2010

12 Técnica do DNA recombinante “Propagação”
O plasmídeo recombinante em contacto com bactérias introduz-se em algumas delas. As bactérias portadoras do plasmídeo sintetizam agora a proteína desejada. Como saber quais as bactérias portadoras do DNA recombinante? IL 2010

13 Técnica do DNA recombinante “Selecção”
Os plasmídeos usados possuem genes que lhes conferem resistência a determinados antibióticos. Num meio com determinado antibiótico, sobreviverão apenas as bactérias resistentes, e portanto portadoras do gene pretendido (com DNA recombinante). IL 2010

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15 Técnica do DNA recombinante “Aplicações”
Estudos de mecanismos de replicação e expressão de genes Determinação da sequência de um gene (e proteína codificada) Aumento no rendimento de plantas Obtenção de organismos geneticamente modificados capazes de produzir substâncias úteis (ex.: insulina humana) … IL 2010

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17 Técnica do DNA complementar
Para obtenção de insulina humana: Antes: Uso de insulina obtida a partir do pâncreas de vacas ou de porcos (provocava por vezes rejeição) Solução? Uso do RNAm existente nas células do pâncreas humano Recurso a uma enzima existente nos vírus: transcriptase reversa (catalisa a formação de DNA a partir de RNA) IL 2010

18 Formação de cDNA A molécula de RNAm, serve de molde à sintese de uma molécula de DNA (já sem intrões e por isso funcional) IL 2010

19 Formação de cDNA O gene isolado que codifica a síntese de insulina pode agora ser inserido numa bactéria e iniciar-se a produção industrial de insulina IL 2010

20 Reacções de polimerização em cadeia (PCR)
Quando é necessária uma quantidade de DNA superior à disponível, como obtê-la? Casos que envolvem as ciências forenses Na década de 80, passou a utilizar-se a técnica do PCR para fazer milhares de cópias de um único segmento de DNA. IL 2010

21 PCR Técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e mais alguns compostos necessários, como primers (DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase (enzima que faz a replicação do DNA). Os primers são fitas de DNA, com mais ou menos 20 bases (A, T, C, G) complementares, isto é se ligam por complementaridade ao início da sequência de DNA que se quer multiplicar.  IL 2010

22 PCR Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada deve-se separar a dupla fita, formando assim duas fitas diferentes mas complementares entre si. Cada fita servirá de molde para a duplicação, por isso, precisamos de dois tipos de primers diferentes IL 2010

23 PCR Obtêm-se uma amostra mínima de DNA de uma célula humana.
A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA polimerase), os nucleótidos de DNA e os primers complementares a sequência de DNA são colocados em um tubo de ensaio. Coloca-se o tubo de ensaio numa máquina de PCR (maquina que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um programa). Os passos seguintes, de aquecimento e arrefecimento, acontecem dentro da máquina controlados pelo programa. IL 2010 Adaptado de

24 PCR Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla cadeia) o DNA. Cada cadeia simples do DNA desnaturado serve de molde para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso submete-se a 54ºC onde os primers servem de iniciadores para a enzima polimerase. Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da cadeia - ligação dos nucleotídos livres por complementaridade à cadeia de DNA ,formando assim uma nova cadeia dupla. Repete-se até obtenção da quantidade necessária. IL 2010 Adaptado de

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