Polymerase Chain Reaction (PCR)

Apresentação em tema: "Polymerase Chain Reaction (PCR)"— Transcrição da apresentação:

1 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Reação em Cadeia da Polimerase (Kary Mullis, 1993)

2 Tópicos PCR Alvos Denaturação Primers Anelamento Ciclos Requerimentos

3 DNA Exemplo de padrão de ligação. Padrão primário CCGAATGGGATGC
GGCTTACCCTACG Padrão complementar

4 DNA Molecule Adenina Timina Guanina Citosina

5 PCR = Polymerase Chain Reaction
ou Reação em cadeia da Polimerase Reação de polimerização em cadeia Polimerização em cadeia do DNA • Técnica de biologia molecular empregada para obter-se amplificação exponencial de pequenas quantidades de DNA in vitro, empregando elementos do processo natural de replicação do DNA. • O conceito de amplificação do DNA não é novo e sempre foi utilizado, entretanto, a amplificação era feita in vivo e não in vitro como na PCR.

6 PCR PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) é uma técnica que amplifica uma sequência específica de DNA, como objetivo de torná-la abundante e disponível para diversas técnicas de biologia molecular.

7 PCR • Fazer in vitro o que ocorre in vivo
– DNA polimerase termoestável (Taq) – Termociclador

8 OS Alvos do PCR Os alvos a serem considerados no PCR são as regiões que flanqueiam a sequência específica de DNA a ser amplificada, a qual pode ser um gene inteiro ou somente uma região pequena.

9 TTAAGGCTCGA . . . . AATTGGTTAA
PCR Targets O número de bases nos alvos pode variar. TTAAGGCTCGA AATTGGTTAA O Representa o meio da sequência de DNA, e não há problemas em não conhecê-la para poder amplificá-la.

10 PCR - Desnaturação A desnaturação é o primeiro passo do PCR, no qual as fitas de DNA são separadas através de aquecimento a 95°C.

11 PCR Primers Os primers são sequências de 15 a 30 nucleotídeos, fita única, que são usadas para flanquearem as extremidades da região a ser amplificada. Marcam o início e o fim da sequência-alvo.

12 PCR Primers Um primer para cada extremidade da sua sequência alvo deve ser desenhado, para que as fitas sejam copiadas simultaneamente em ambas as direções.

13 PCR Primers TTAACGGCCTTAA . . . TTTAAACCGGTT
AATTGCCGGAATT > e < AAATTTGGCCAA

14 PCR Primers OS primers são colocados em excesso na reação de PCR, para que eles se liguem ao DNA alvo, ao invés das duas fitas se ligarem de novo uma a outra.

15 PCR - Anelamento O anelamento é o processo através do qual duas sequencias de nucleotídeos são ligadas através da formação de pontes de hidrogênio. Na reação de PCR, o anelamento se dá através da ligação dos primers com o DNA Alvo, a temperatura de 55°C.

16 PCR Taq DNA Polimerase O nome Taq vem de Thermus aquaticus, a qual é uma bactéria encontrada sobrevivendo a altas temperaturas em geisers no Yellow Stone National Park.

17 PCR Taq DNA Polimerase Essa bactéria produz uma enzima DNA polimerase, a qual amplifica o DNA a partir do anelamento com os primers, na presença de Mg, a altas temperaturas.

18 PCR Ciclos

19 PCR Ciclos

20 PCR Ciclos

21 PCR Ciclos

22 PCR Cycles

23 PCR Ciclos Desnaturação: 94°- 95°C Anelamento: 55°- 65°C Extensão: 72°
Número de ciclos: 25-40

24 • Desnaturação do DNA molde (template) por aquecimento
• Pareamento dos primers à seqüência alvo fita simples • Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável

25 PCR Ciclos

26 Primeiro ciclo da PCR

27 Após sucessivos ciclos

28 PCR Ciclos

29 PCR Ciclos Número de cópias da Região alvo de DNA A = 2n
n = número de ciclos

30 PCR Requerimentos Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM Tampão: pH 8.3-8.8
dNTPs: µM Primers: µM DNA Polimerase: units DNA Alvo:  1 µg

31 OTIMIZAÇÃO DA PCR – POR QUÊ?
Otimizar a amplificação para: Aumentar a quantidade de produto final (eficiência) Aumentar a especificidade, principalmente quando há grande background Melhorar a reprodutibilidade (de tubo para tubo e de reação para reação) Parâmetros a serem considerados na otimização: Desenho dos primers Condições de ciclagem Concentração dos reagentes Composição do tampão

32 DESENHO DOS PRIMERS Tamanho ideal:
- O tamanho ideal de um primer depende de seu conteúdo de A+T e da Tm do primer oposto - Deve ser complexo o suficiente para evitar o pareamento em regiões inespecíficas Usualmente oligonucleotídeos de ~20 bases (a probablididade de uma sequência específica de 20 bases ocorrer em um genoma é uma vez a cada 420 bases)

33 (bandas inespecíficas)
TEMPERATURA DE ANELAMENTO MAIS ESPECIFICIDADE (menor rendimento) MENOS ESPECIFICIDADE (bandas inespecíficas) Desenho dos primers • O pareamento específico depende criticamente da temperatura, além de ser influenciado pela concentração de cátions, pelo tempo na temperatura de pareamento e outros fatores • A temperatura de pareamento deve ser a mais alta possível Cálculo da Tm (< 20 bases) Tm = 4(G+C) + 2(A+T) oC Tanel = Tm – 4oC

34 Desenho dos primers RECOMENDAÇÕES: • Tamanho: 15 a 20 bases • Sequência: 40-50% de G+C distribuídos aleatoriamente • Checar para formação de estruturas secundárias internas • Evitar complementariedade entre os pares de primers, principalmente na posição 3’ (primer-dimer ou dímeros de primers)* • Checar se o par de primers tem Tanel próximas (no máximo, de 2 a 3ºC de diferença)

35 Touch down PCR – melhora rendimento da PCR:
Exemplo: variar a temperatura de pareamento (Tanel) entre 65oC e 55oC, reduzindo a temperatura em 1oC a cada 2 ciclos, durante 20 ciclos. Fazer mais 10 ciclos a 55oC PCR Gradiente – permite ajuste preciso da Tanel: Exemplo: Correr uma série de reações com diferentes Tanel no mesmo bloco considerando-se a temperatura média de anelamento e a faixa de variação – 61oC ± 10oC Nos ciclos iniciais da PCR a proporção primer-template deve ser 107 (excesso de primer): para amostras muito diluídas (100 cópias de template ou menos) há risco de formação de dímeros de primers (*). Booster PCR – inicia-se a reação com concentração menor de primer e após alguns ciclos eleva-se a concentração

36 • Primers de um par devem ser usados na mesma concentração • Excesso de primers induz a formação de produtos inespecíficos e formação de dímeros de primers

37 Condições de ciclagem • A duração da etapa de extensão (72ºC) deve ser calculada em função do tamanho do produto que se deseja amplificar • Em geral utiliza-se 1 min/kb de produto – mais do que suficiente pois a extensão terá início durante a etapa de pareamento e durante a elevação da temperatura até 72ºC

38 PCR convencional – Three step
1- Denaturação inicial – 2-3min a 95ºC 2 – Denaturação, 15s a 95ºC 3 – Paremento, 15s a xoC (x depende da Tm) 4 - Extensão, x min a 72ºC (x depende do tamanho do produto 1min/kb) 5 – Voltar ao passo 2 por ciclos adicionais Two step – alta especificidade, menor tempo de ciclagem Primer Tm > 65ºC 1- Denaturação inicial – 2-3min a 95ºC 2 – Denaturação, 15s a 95ºC 3 – Paremento e Extensão simultâneos, x min a 68ºC – x depende do tamanho do produto (1min/kb) 4 – Voltar ao passo 2 por ciclos adicionais

39 Íons Mg2+ são necessários para estimular a enzima Taq DNA polimerase

40 Otimização da [Mg2+]: Efeitos da variação de Mg2+:

41 INIBIÇÃO DA PCR • Contaminantes da amostra de DNA podem inibir fortemente a PCR Inibidores da DNA polimerase: - Fenol - Proteinase K - Agentes quelantes em excesso (EDTA) - Elevadas concentrações de sal - SDS

42

43 MÉTODOS QUE EMPREGAM A PCR:
• RAPD – Random amplified polymorphic DNA • AFLP – Amplified fragment length polymorphism • Multiplex-PCR • PCR-RFLP • Long-PCR • RT-PCR (Reverse Transcriptase) • RT-PCR (Real Time) - quantitativo

44 Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar, extrair e descartar o plasma, com o cuidado de Não remover a faixa de células brancas.

45 Extração de DNA de células sanguíneas
Extrair cuidadosamente 200ul da região de células brancas E separar em tubos identificados

46 Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar Protease a Cada tubo Tampão de Lise em cada tubo

47 Extração de DNA de células sanguíneas
Realizar Homogeneização Criteriosa do material

48 Extração de DNA de células sanguíneas
Incubar os tubos A 56C por pelo Menos 10min.

49 Extração de DNA de células sanguíneas
Centrifugar os tubos para retirar quaisquer grumos Adicionar etanol para lavagem e centrifugar de novo.

50 Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar as amostras em colunas de afinidade e centrifugar .

51 Extração de DNA de células sanguíneas
Tubo com coluna A coluna vai ser retirada e adaptada em outro tubo no qual será feita a eluição Coluna. Esse eluato (flow through) será Descartado.

52 Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna será colocada em um novo tubo, aonde será Lavada mais duas vezes com tampão, para retirar quaisquer Moléculas que não estejam ligadas fortemente a coluna.

53 Extração de DNA de células sanguíneas
A coluna com o tubo é então centrifugada Mais uma vez, para remover excesso de Tampão de Lavagem. O próximo passo é adicionar Tampão de Eluição Incuba-se por 30 minutos a 25ºC O eluato da coluna é então guardado, pois agora esse contém o DNA Alvo.

54 Extração de DNA de células sanguíneas
Então pode-se preparar o mix de PCR. Mix de PCR 10x Buffer - 10 µl MgCl - 6 µl dNTPs- 0.8 µl Primer forward - 2 µl Primer reverse - 2 µl Taq polimerase µl H2O estéril µl

55 Extração de DNA de células sanguíneas
Adicionar ao mix de PCR a amostra de DNA em tubos Específicos e colocar em termociclador.

56

57

58 Preparo do gel de agarose

59

60 Extração de DNA de células sanguíneas
Análise do produto de PCR.

61 DERIVAÇÕES DA PCR • RT-PCR – PCR para RNA
• Nested-PCR – Iniciadores internos • PCR Multiplex – Vários iniciadores • LSSP-PCR – PCR em baixa estringência com um só iniciador • PCR competitivo – utilização de um DNA conhecido de concentração conhecida que compete com o DNA molde a ser identificado • PCR em Tempo Real (Real Time PCR) – visualização da reação de PCR com possibilidade de quantificação através de um termociclador acoplado a um espectrofotômetro.

62 FATORES QUE INFLUENCIAM OS RESULTADOS DE PCR
• Tamanho e composição dos iniciadores • Temperatura de ligação • Concentração do DNA molde • Concentração de MgCl2 • Número de ciclos • Presença de contaminantes • Eletroforese

63 Bibliografia Alberts, Brown,Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. Use of PCR in Forensic Science Online. Internet. 18 Jan Available forensci_PCR.htm.l Brown, John C. What The Heck Is PCR? Online. Internet. 18 Jan Available Photographs: Courtesy of UMC clinical lab and Tom Wiggers.

64 Bibliografia Ronald H. Holton, Ph.D.:
Molecular Diagnostics in the Clinical Laboratory Molecular Biology in the Clinical Laboratory Molecular Pathology: Basic Methodologies and Clinical Applications Expanding applications of PCR, by Peter Gwynne and Guy Page