Microarranjos de DNA Karine Begnini.

Apresentação em tema: "Microarranjos de DNA Karine Begnini."— Transcrição da apresentação:

1 Microarranjos de DNA Karine Begnini

2 Coleção de sondas de DNA marcadas em meio sólido de forma ordenada
MICROARRANJOS DE DNA Técnica que utiliza fragmentos de DNA fixados à uma superfície sólida, no qual as amostras são hibridizados para analisar a expressão de genes simultaneamente ou genotipar regiões de interesse do genoma Coleção de sondas de DNA marcadas em meio sólido de forma ordenada

3 MICROARRANJOS DE DNA DNA, tRNA ou cDNA
Spots de DNA: sequências conhecidas de DNA de interesse (probes). Tamanho de ~100 µm de diâmetro DNA, tRNA ou cDNA

4 MICROARRANJOS DE DNA

5 Década de 80: Edwin Southern desenvolveu e patenteou a técnica
1991: Cientistas da Affymax desenvolvem os primeiros chips de DNA 1993: Affymetrix: desenvolvimento de chips  1994: Primeiras coleções de cDNA 1995: Expressão gênica Chips em laboratório 1996: Testes e comercialização dos chips Francis Collins – mutações BRCA1 – câncer de mama Construção de chips com muitos genes (6000 genes de levedura)

6 UTILIZAÇÕES Análise de expressão Genotipagem de SNP
Detecção/caracterização patógenos Sequênciamentos Identificação de inserções Análise de metilação de DNA Estudos de interação proteína/DNA

7 UTILIZAÇÕES Por que usar Microarray para análise de expressão?
Análises de expressão convencionais somente permite o estudo de um ou poucos genes em um experimento Permite o estudo da expressão de milhares de genes em um único experimento Permite a análise da expressão global de genes o que não é possível em técnicas convencionais

8 Microarray x Outras técnicas
Southern blot Microarray Electrophoresis and Blotting Labeled probe – gene “X” RNA Control Cells Treated Hybridization Treated Cells RNA Control Label with Cy3 Label with Cy5 Hybridize, wash, and scan Microarray containing 16 probes

9 Microarray x Outras técnicas
PCR em tempo real Treated Cells RNA Control Label with Cy3 Label with Cy5 Hybridize, wash, and scan Microarray containing 16 probes

10 Tipos de Microarranjos
Spotted Arrays Affymetrix Arrays Homemade Desenhado Máximo de análises por experimento Susceptível a variabilidade Disponível comercialmente Definido anteriormente Máximo de análises por experimento Menos variável

11 Experimentação Obtenção da amostra (DNA/RNA)
Método de detecção (corantes) 3. Leitura

12 Obtenção da amostra (DNA/RNA)
RNA – cDNA • Métodos de extração: * Trizol ou outros métodos similares * Livre de proteína, de DNA e de inibidores

13 Obtenção da amostra (RNA)
CUIDADOS: Possibilidade de presença de DNA genômico ou proteínas contaminando as preparações de RNA- falso positivo RNA é um material bastante sensível e exige cuidados especiais de manipulação e armazenamento. DNA A260/280 é ~1.8 RNA A260/280 é ~2

14 Síntese de cDNA

15 Preparo da amostra

16 Corantes Cianinas sintéticas Cy3  fluorescência verde
Cy5  fluorescência vermelha

17 Leitura O laser escaneia o array e produz imagens
Um laser para cada cor (um para verde, outro para vermelho) Análise da imagem: Supressão de background Localização e detecção dos spots, incluindo a redução da intensidade de background, posição do spot e tamanho deste.

18 Leitura Dados apresentados em escala de cor Somente usada razão
Verde: reprimido (menos mRNA) Vermelho = induzido (mais mRNA) Preto = sem mudança (1:1 ratio) Somente usada razão - Valores <1 (reprimido) - Valores >1 (induzido)

19 Leitura Fold induction – quantas vezes
Expressão como repressão ou indução (Y-fold) Calculado como o inverso da razão Razão de 0.33 = repressão 3-fold Razão de 10 = indução de 10-fold

20 Leitura Block Column Row Gene Name Red Green Red:Green Ratio 1 tub1
2,345 2,467 0.95 2 tub2 3,589 2,158 1.66 3 sec1 4,109 1,469 2.80 4 sec2 1,500 0.42 5 sec3 1,246 1,258 0.99 6 act1 1,937 2,104 0.92 7 act2 2,561 1,562 1.64 8 fus1 2,962 3,012 0.98 9 idp2 3,585 1,209 2.97 10 idp1 2,796 1,005 2.78 11 idh1 2,170 4,245 0.51 12 idh2 1,896 2,996 0.63 13 erd1 1,023 3,354 0.31 14 erd2 1,698 2,896 0.59

21 Real DNA Microarray

22 Amostras de células tratados com
Exemplos Amostras de células tratados com composto X

23 Exemplos Expressão de genoma viral ao longo de
determinado intervalo de tempo

24

25

26 Exercício 1 Paciente A: tem 5 genes (A2, A3, B1, B3, C4) que são muito ativos na ALL. Os outros genes são controles que não nos fornecem informação sobre o tipo de câncer. Podemos assim concluir que este paciente sofre de ALL. Paciente B: tem 2 genes (A4, B2) que são altamente expressos na AML. Os outros genes presentes são controles. Como dos 10 genes que normalmente estão ativos na AML, só dois estão ativos neste paciente, não podemos concluir se tem AML ou ALL. Pode ter outro tipo de câncer ou por exemplo estar no início de AML. Doente C: tem 6 genes (A1, A4, B2, C3, D2, D3) que são muito ativos nos tecidos com AML. Os outros genes são controles. Este paciente sofre provavelmente de AML.