Tecnologia do DNA Recombinante Tecnologia do DNA recombinante

Apresentação em tema: "Tecnologia do DNA Recombinante Tecnologia do DNA recombinante"— Transcrição da apresentação:

1 Tecnologia do DNA Recombinante Tecnologia do DNA recombinante
Enzimas de Restrição (endonucleases): tesouras do DNA enzimas produzidas por bactérias para restringir a proliferação de vírus invasores; diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequências de bases de DNA; reconhecem e clivam o DNA em pontos específicos, geralmente em sequências de 4, 6 e 8 bases – palíndromas. Nomenclatura: as enzimas de restrição são chamadas de acordo com a bactéria que a produziu: Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Izosquizomeros: diferentes enzimas de restrição que possuem a mesma sequência de reconhecimento Tecnologia do DNA recombinante

2 Tecnologia do DNA recombinante
Extremidades: coesivas X “cegas” coesiva = EcoRI = “cega” = SmaI = 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCC GGG-3’ 3’-GGG CCC-5’ -3’ Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Tecnologia do DNA recombinante

3 Tecnologia do DNA recombinante
Cortando e Juntando o DNA.... Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Tecnologia do DNA recombinante

4 Tecnologia do DNA recombinante
Amplificação do DNA recombinante.... Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Tecnologia do DNA recombinante

5 Tecnologia do DNA recombinante
Escolha de um vetor de clonagem: molécula pequena – fácil manipulação capaz de se replicar em uma célula viva presença de sítios de restrição para inserção do DNA a ser clonado possuir um método de identificaçãoe recuperação das moléculas recombinantes Ex: pUC18 ampR - bactérias transformadas serão resistêntes a ampicilina popiligador – sítio de clonagem múltipla lacZ’ - codifica para –galactosidade que converte X-Gal em um corante azul Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Tecnologia do DNA recombinante

6 Tecnologia do DNA recombinante
Construção de uma biblioteca de DNA Construção de uma biblioteca de cDNA cDNA = DNA complementar; feito a partir do mRNA; não tem introns Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Tecnologia do DNA recombinante

7 Tecnologia do DNA recombinante
Uso do DNA clonado como sonda transferência de Southern (E.M. Southern) - DNA transferência de Northern- RNA transferência de Western - PTN Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Tecnologia do DNA recombinante

8 Tecnologia do DNA recombinante
Mapas de Restrição É uma compilação do número, da ordem e da distância entre locais do corte da enzima de restrição ao longo de um segmento de DNA As unidades do mapa são expressadas em pares de bases ou para distâncias mais longas em pares de kilobases O DNA encontra-se, geralmente, dentro de um vetor bem caracterizado do plasmídeo ou do bacteriófago, onde a sequência é conhecida Normalmente, o mapeamento é a primeira etapa para caracterizar um DNA desconhecido e um pré-requisito para manipulá-lo para outras finalidades. Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Tecnologia do DNA recombinante