Polimorfismos de nucleotídeos únicos em espécies poliplóides

Apresentação em tema: "Polimorfismos de nucleotídeos únicos em espécies poliplóides"— Transcrição da apresentação:

1 Polimorfismos de nucleotídeos únicos em espécies poliplóides
LGE - Laboratório de Genômica e Expressão Ramon Oliveira Vidal Doutorando em Genética e Biologia Molecular Sub área: Bioinformática Orientador: Gonçalo A.G. Pereira @ramonvidal

2 Tópicos da Apresentação
Marcadores Moleculares Marcadores por Hibridação Marcadores por Amplificação Polimorfismos X mutações SNPs Origem Aplicações Haplótipos Genotipagem Identificando os SNPs (em genomas e transcriptomas) Sanger 454 Solexa Taxa de evolução Identificação de SNPs em Coffea arabica

3 Fenótipo e Genótipo Fenótipo Genótipo
Propriedades observáveis de um indivíduo, que se desenvolveram sob a influência de: genótipo do indivíduo fatores ambientais Genótipo Constituição genética de um organismo como revelada pela análise genética e molecular, ou seja, o conjunto completo de genes, tanto dominantes e recessivos.

4 Marcadores Qualquer característica morfológica ou molecular que diferencia indivíduos, e que seja facilmente detectável

5 Marcadores Morfológicos
É um fenótipo de fácil identificação, normalmente determinado por um único alelo. Características fenotípicas de fácil identificação visual são utilizadas como marcadores morfológicos desde os tempos de Mendel

6 Marcadores de DNA (moleculares)
Polimorfismo detectado na seqüência de DNA Vantagens: - Não é objeto de influências ambientais; - Praticamente ilimitado em número; Maior desvantagem é a necessidade de técnicas e equipamentos mais complexos.

7 Características Desejáveis aos marcadores moleculares
Reprodutibilidade; Amplamente distribuído através do genoma; Poder de discriminação; Ausência de influências ambientais; Barato; Fácil de mensurar

8 Alguns conceitos básicos
Diplóide: Constituído por duas cópias (homólogos) de cada cromossomo. Alelo: As formas alternativas de um caráter genético encontrado em um determinado locus de um cromossomo. Homozigotos: Um organismo diplóide com alelos idênticos de um determinado gene em ambos os cromossomos homólogos. Heterozigotos :Um organismo diplóide com alelos diferentes de um determinado gene em ambos os cromossomos homólogos.

9 homozigoze Diplóide Alelos heterozigoze Haplóide

10 Tipos de marcadores Hibridação Amplificação de DNA
RFLP – (Restriction Fragment Length Polymorphism) Minissatélites – VNTR –(Variable Number of Tandem Repeats) Amplificação de DNA RAPD – (Random Amplified Polymorphic DNA) SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions) ou ASA (Amplified Specific Amplicon) Microssatélites –SSR (Simple Sequence Repeats) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

11 RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

12 RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism

13 RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA
Polimorfismo de DNA entre indivíduos pode ser devido a: Ausência do sítio do primer. Surgimento de um novo sítio. Ao comprimento da região amplificada entre sítios de primer

14 Microssatélites – SSR (Simple Sequence Repeats)
Significa Seqüências Simples Repetidas, a qual consiste de pequenas seqüências de nucleotídeos (1 a 4) repetidas em tandem. Essas seqüências são distribuídas ao acaso no genoma e é um dos marcadores mais utilizados atualmente

15 Microssatélites – SSR (Simple Sequence Repeats)
Primers específicos (20 a 30 pb). Diferentes números de elementos simples repetidos. Cada segmento amplificado de tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo loco

16 Genótipos na eletroforese

17 Polimorfismos genéticos X Mutações genéticas
Alteração na seqüência de nucleotídeos de uma molécula de DNA. O termo "mutação“ é geralmente usado para referir-se a alterações na seqüência de DNA que não estão presentes na maioria dos indivíduos de uma espécie Polimorfismos genéticos Diferença na seqüência de DNA entre indivíduos, grupos ou populações. Incluem SNPs, seqüências repetitivas, inserções, deleções e recombinações. Podem dar origem a olhos ou olhos castanhos, cabelo liso ou cabelos crespo Resultado de processos naturais ou induzidos por agentes externos (como vírus ou radiação).

18 Polimorfismos genéticos X Mutações genéticas
Polimorfismos são alterações no DNA que se mantém nas gerações futuras Polimorfismo: variação >1% Mutação: variação <1% C T T A G C T T 99.9% C T T A G C T T 94% 6% C T T A G T T T 0.1% C T T A G T T T Polimorfismo Mutação

19 Polimorfismos genéticos X Mutações genéticas
First & Last Name February X, 2005 Polimorfismos genéticos X Mutações genéticas TAAAAAT TAACAAT TAAAAAT TAACAAT Polimorfismos foram mutações que se propagaram ao longo de gerações (c) 2005 CGDN

20 SNPs Single Nucleotide Polymorphism, ou SNP ("snip"):
pequena mudança, ou variação, que pode ocorrer em um único nucleotídeo numa sequência de DNA em uma porção significativa (mais de 1%) de uma população.

21 Single Nucleotide Polymorphism
SNPs são as mais frequêntes formas de variações genéticas 90% das variações genéticas humanas vêm dos SNPs SNPs tem se tornado marcadores de preferência pela sua grande abundância e pelo desenvolvimento de tecnologias de genotipagem em larga escala.

22 Distribuição dos SNPs SNPs em menor quantidade em genes do que em regiões não- codificantes Menor quantidade de SNPs nos cromossomos sexuais (humano). Dentro de um único cromossomo, SNPs podem se concentrar em uma região específica, geralmente implicando uma região de interesse ou de pesquisa. Em média, ocorrem a cada 300~600 nucleotídeos (humano). Genes com maior pressão para modificação tem maior frequência de SNP (resistência, adaptação, interação parasita-hospedeiro, etc)

23 SNPs intra/inter específicos
Intra espécie Diversidade entre os indivíduos de uma mesma espécie Reflete os SNPs entre os alelos (espécies diplóides) Inter espécies Diversidade entre espécies diferentes

24 Classificação dos SNP Transições Purina<->Purina
Pirimidina<->Pirimidina Transversões Purina<->Pirimidina Não-codificantes Codificantes As sinônimas alteram o trna e pode fugir no uso do codon influenciando na expressao do gene. Dar exemplos de cada um dos tipos Sinônimas Não-sinônimas conservativas Não-conservativas

25 Detecção de genótipos de individuos.
Genotipagem Detecção de genótipos de individuos. Pode ser realizada observando os SNPs. Haplótipo (genótipo haplóide) Alelo encontrado em um único cromossomo que apresenta o mesmo padrão de SNPs. Blocos haplótipos e tendem a ser herdados juntos. Podem servir como marcadores de doença genética. A análise de haplótipos é útil na identificação de eventos de recombinação. Colocar figuras

26 Blocos de haplótipos Dentro de um bloco haplótipo, acontece pouca ou nenhuma recombinação Os SNPs dentro de um bloco haplótipo são passados juntos nas gerações futuras

27 haplótipos Um haplótipo é um conjunto de SNP no mesmo cromossomo
-A C T T A G C T T- -A A T T T G C T C- -A C T T T G C T C- Haplotype 2 Haplotype 3 C A T A T C C T C Haplotype 1 SNP1 SNP2 SNP3 SNP1 SNP2 SNP3

28 Zonas de recombinação e Blocos de haplótipos
SNP loci Haplotype patterns : Major allele : Minor allele I1 I2 Recombination hotspots Chromosome Haplotype blocks C2 SNP loci

29 Blocos de Haplótipos SNPs estão relacionados com a diversidade de genótipos de humanos podem ser mapeados relacionando-os a diversidade de fenótipos. Um SNP individual ou um bloco haplótipo pode servir de indicação para características agronômicas doenças etc Essa relação constitui a base e a motivação para a identificação e genotipagem de SNPs.

30 Genotipagem e utilizando SNPs como marcadores
O genoma de cada indivíduo contém distintos padrões de SNPs Pessoas podem ser agrupadas de acordo com esse perfil Perfil de SNPs são importantes na identificação de respostas a terapias Existe uma correlação entre certos perfis de SNPs e respostas específicas a tratamentos Precisa de ilustração

31 Identificação de SNPs através da análise de sequencias
Genoma/transcriptoma Sanger 454 Solexa/Solid/... Alinhamento de sequências Identificação de Discrepâncias

32 Mineração de SNPs baseados no sequenciamento
Encontrando SNPs: Mineração de SNPs baseados no sequenciamento (Sanger tradicional) Genomic BAC Library RRS Overlap Shotgun mRNA cDNA Library EST Overlap Sequenciamento De DNA Chips de SNPs

33 Mineração de SNPs baseados no sequenciamento
Encontrando SNPs: Mineração de SNPs baseados no sequenciamento DNA from multiple individuals Fragment DNA Sequence and Reassemble (known sequence) Assembly with other overlapping mismatches = SNPs GTTACGCCAATACAGGATCCAGGAGATTACC GTTACGCCAATACAGCATCCAGGAGATTACC

34 Amplificação do DNA Phred Phrap PolyPhred Consed Analysis
Sequenciamento Base-calling Contig assembly 5’ 3’ Vários indivíduos PolyPhred Polymorphism detection Consed Sequence viewing Polymorphism tagging Excluir esse slide talvez Analysis Relatório de polimorfismos Genotipagem individual Lecture 7.0

35 SNP Discovery - Sanger sequencing (EST)

36 SNP Discovery - Diploids (heterozygous loci)

37 Sequenciamentos de Nova geração para a identificação de SNPs

38 Sanger vs NGS Método Sanger foi o único utilizado por 30 anos
Sanger processa em paralelo 96 sequencias enquanto NGS processa milhões de sequencias a um custo 6X menor. Problemas: Fidelidade dos dados Tamanho dos reads Custo da infraestrutura Manipular grandes volumes de dados

39 Problemas do tamanho da sequência
ACTTAAGGCTGACTAGC TCGTACCGATATGCTG Sequencias curtas não mapeiam unicamente em um lugar no genoma. Solução #1: Reads longos. Solução #2: Reads pareados.

40 Sequenciamentos de Nova Geração

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42 Ferramentas para descoberta de SNPs em reads curtos
Necessário ter uma montagem de referência Mapeamento dos reads na referencia Coberturas médias necessárias: Solexa - 100X, X Análise estatística para validar discrepâncias com base na redundância dos dados Muitos Softwares disponíveis Desenvolvimento de algorítmos para aumentar velocidade de processamento

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44 SNP Discovery: Goal sequencing errors SNP

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47 SNP Discovery haploid diploid AACGTTAGCATA AACGTTAGCATA strain 1
AACGTTCGCATA strain 1 individual 1 AACGTTCGCATA strain 2 AACGTTCGCATA AACGTTAGCATA individual 2 strain 3 AACGTTAGCATA individual 3

48 Taxa de Evolução – kaks ou dn/ds
Para inferir uma taxa de evolução a um gene são estimados o KA e o KS KA - é a relação entre substituições não sinônimas e todos os possíveis sitios não sinônimos KS – é a relação entre substituições sinônimas e todos os possíveis sítios sinônimos

49 Exemplo: Prolina: CCT CCA CCG CCC Um sítio sinônimo e dois não sinônimos

50 KA/KS (dn/ds) A taxa KA/KS é uma medida clássica da evolução de maneira global num gene KA/KS << 1 indica que uma substancial proporção de mudanças de aminoácidos devem ter sido eliminadas por seleção de purificação. KA/KS > 1 indica seleção adaptativa ou positiva

51 KaKs_calculator - Métodos
NG: Nei, M. and Gojobori, T. (1986) - Faster LWL: Li, W.H., et al. (1985) LPB: Li, W.H. (1993) and Pamilo, P. and Bianchi, N.O. (1993) MLWL (Modified LWL), MLPB (Modified LPB): Tzeng, Y.H., et al. (2004) YN: Yang, Z. and Nielsen, R. (2000) MYN (Modified YN): Zhang, Z., et al. (2006) GY: Goldman, N. and Yang, Z. (1994) MS (Model Selection), MA (Model Averaging)

52 A taxa de KAKS em humanos e chimpanzes é de 0,23.
Assumindo que mutações sinônimas são neutras, esse resultado implica que 77% das alterações de aminoácidos em genes hominideos são suficientemente deletérias e são eliminadas por seleção natural. Como mutações sinônimas não são totalmente neutras, a proporção de alterações de aminoácido neutras com consequências deletérias deve ser maior

53 Identificação de SNPs e haplótipos na poliplóide Coffea arábica

54 Objetivos principais Identificar e caracterizar SNPs em sequências de EST Identificar os haplótipos com base nos padrões de SNPs Identificar kaks Foram utilizados dados de duas espécies de café: Coffea arabica, Coffea canephora

55 Coffea canephora Espécie diplóide Polinização cruzada: Alógama.
Alta variabilidade C. canephora é melhor adaptada ao clima equatorial úmido e quente Cultivada em baixas e médias altitudes Qualidade de bebida inferior Mais resistente a diversas condições do que Coffea arabica, em particular a doenças e pragas.

56 Coffea arabica Allopoliploide (tetraplóide) Autógama
Baixa variabilidade Originada de um cruzamento recente (1mya) entre Coffea eugenoides e Coffea canephora Espécie mais cultivada. Ocupa 75% das plantações mundiais de café. Qualidade da bebida excelente.

57 Poliploidia

58 Softwares CAP3 para montagem dos EST QualitySNP KaKs_calculator
Scripts PERL

59 A montagem 95% similaridade por 100bp
Previnir agrupamento de parálogos Remover clusters com menos de 4 ESTs Remover clusters com mais de 500 ESTs Evitar contigs mal formados

60 QualitySNP Analisar informações do CAP3 (Arquivo ACE) Detecção de SNPs
Filtros Reconstrução de haplótipos Detecção de polimorfismos sinônimos e não sinônimos com o FASTY Construir Banco de dados com os dados gerados.

61 Filtro 1 – Detectar SNPs potenciais
Detecta todos os SNPs bi, tri e tetra alélicos Cada alelo é representado com mais de uma sequencia. Excluindo SNPs singlets Classificação dos SNPs como intra ou inter espécies

62 Filtro 2 – Reconstrução dos haplótipos
Agrupa sequências que representam um mesmo alelo Tem os mesmos nucleotídeos nos sítios polimorficos. Utiliza métodos matemáticos para minimizar falsas reconstruções de haplótipos Exclui haplótipos formados por apenas uma sequencia

63 Filtro 3 – Busca SNPs com alto score de confiabildade
É calculado de acordo com a ocorrencia do SNP em cada alelo com relação às regiões de alta e baixa qualidade O score de confiabilidade é o menor valor Descartados valores abaixo de 2

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66 Identificação de SNPs não-sinônimos
Fasty Produz menores alinhamentos em sequencias de baixa qualidade Detecção da ORF Correção de frameshifts Detecção de sSNP/nsSNP e SNPs ou INDELs em regiões UTR Kaks Calculator

67 The database

68 Resultados Identificação dos ancestrais haplótipos
Padrões diferentes de expressão dos homeologos Contribuição de cada ancestral de arabica no transcriptoma relacionando ao fenótipo Genes com maior pressão seletiva para mudança Genes com maior pressão seletiva para estabilização Artigo submetido e em revisão

69 LGE - Bioinformática Genômica, Transcriptômica, Biologia Sintética, Biologia de Sistemas

70 Projetos

71 Projetos

72 Projetos

73 Projetos

74 Projetos

75 Projetos

76 Projetos

77 Projetos

78 Projetos

79 Projetos

80 O LGE

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