SIANNAH MARIA MAS DIEGO

Apresentação em tema: "SIANNAH MARIA MAS DIEGO"— Transcrição da apresentação:

1 SIANNAH MARIA MAS DIEGO
Enzimas – Parte 2 JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Estágio em Docência Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008

2 Enzimas Atividade enzimática Produção industrial de enzimas
O processo fermentativo; Separação de enzimas intra e extracelulares; Purificação; Controle de pureza; Produto final.

3 Atividade Enzimática As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas O que importa não é a massa, mas a atividade Conserva a massa protéica Proteínas desnaturadas Sem atividade catalítica

4 Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade
Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza ([S] ou [P]) uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) velocidade constante Produto µmol/mL Tempo (min.)

5 Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade
Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) velocidade decresce Produto µmol/mL ↓ [ ] de substrato: -inativação parcial da enz., -inibição por produto. Tempo (min.)

6 Atividade Enzimática Dosagem: através da medida de sua atividade
Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.) velocidade constante Para evitar a influência destes fatores associar- se: atividade medida da velocidade de reação em condição inicial (Veloc. Constante) Produto µmol/mL velocidade decresce ↓ [ ] de substrato: inativação parcial da enz., inibição por produto e deslocamento do equilíbrio (reação reversível). Tempo (min.)

7 Atividade Enzimática A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades Internacionais (UI). 1 UI é a quantidade de enzima capaz de formar 1µmol de produto por minuto em condições ótimas

8 Atividade Enzimática Métodos para a determinação da atividade de enzimas: Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo. Métodos para avaliar as [ ] das espécies: Muito diretos: - Espectrofotometria, Titulometria... Menos diretos: - Medida da Viscosidade.

9 Significa que o procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis.
Atividade Enzimática A medida da atividade enzimática é imprescindível para monitorar a purificação de uma enzima. A atividade específica: número de Unidades de enzima miligramas de proteína Portanto se a etapa de purificação for bem sucedida a atividade específica deve Significa que o procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis.

10 Caldo contendo a enzima
Atividade Enzimática Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo. 2 mL 8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC Caldo contendo a enzima Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min  2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml

11 Caldo contendo a enzima
Atividade Enzimática Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo. 2 mL 8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC Caldo contendo a enzima Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg 20 mg em 10 min  2 mg/min ou 120 mg/h A = 120/2 = 60 U/ml mL - 60mg amido – 1 h

12 Produção Industrial de Enzimas
Fonte Lípase Pancreática, Pepsina Animais Vegetais Bromelina, Papaína Lactase: S.fragilis, Lipase: A.niger Microrganismos

13 Produção Industrial de Enzimas
A produção se faz majoritariamente por fermentação submersa Nos países orientais há uma tradição estabelecida de utilização da fermentação semi-sólida. Interessante para países que dispõem de resíduos agroindustriais - baixo custo

14 Produção Industrial de Enzimas
Processo importantes prévios à fermentação preparo do inóculo. Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada. Decorrido o tempo suficiente, essa cultura é inoculada no fermentador principal. Quantidade de inoculo: 1 a 10% (p/v) A produção da enzima pode ser afetada por esse parâmetro.

15 Produção Industrial de Enzimas
Linhagem microbiana Sigilosamente protegida Composição dos meios de cultivo Quimicamente conhecidos (sintéticos) Matérias-primas naturais Fontes de carbono e energia, nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento

16 Produção Industrial de Enzimas
Fermentadores Mecanicamente agitados; a litros; Operados de modo descontínuo (batelada); Munidos de camisas ou serpentinas internas para as necessidades de aquecimento e refrigeração; Sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido e espuma); As fermentações em batelada para produção de enzimas tem duração da ordem de 30 a a150 h.

17 Produção Industrial de Enzimas
Processo a jusante (downstream) da fermentação As operações que se seguem ao processo fermentativo Dependem da localização da enzima de interesse Intracelular Extracelular

18 Extração – Enzimas Extracelulares
O caldo é resfriado a cerca de 5°C, Estabilidade do produto e Evitar o crescimento de microrganismos contaminantes. O pH é geralmente ajustado para o valor ótimo de atuação da enzima. A separação das células Centrifugação Filtração

19 Extração – Enzimas Extracelulares
Solução clarificada contendo a enzima (livre de células) Concentração Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos com menbranas) Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)

20 Extração – Enzimas Extracelulares
Solução clarificada contendo a enzima (livre de células) Concentração Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos com menbranas) Esta solução diluída a níveis convenientes e acondiciona com estabilizantes da atividade enzimática pode ser embalada para comercialização. Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)

21 Extração – Enzimas Intracelulares
Caldo de Cultivo Centrifugação Romper as Células Biomassa

22 Extração – Enzimas Intracelulares
Moagem com Esferas de Vidro Homogeneização em Alta Pressão Romper as Células Tratamentos Enzimáticos Sonificação Tratamentos Químicos

23 Extração – Enzimas Intracelulares
A ruptura das células libera inúmeras substâncias para o meio aquoso Ácidos Nucléicos Precipitação Mn II Sobrenadante Filtração Ultrafiltração Concentrado Concentração à vácuo

24 Purificação Forma de apresentação e pureza Concentrado Enzimático
Processo Iguais

25 Purificação Forma de apresentação e pureza Concentrado Enzimático
Processo Iguais Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização (spray drying) diluída pode ser um produto comercializável

26 Purificação Forma de apresentação e pureza Concentrado Enzimático
Processo Iguais Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização (spray drying) Peletizacao ou aglomeração diluída pode ser um produto comercializável Padronização da atividade com material sólido inerte

27 Concentrado Enzimático
Purificação Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. (NH4)2SO4 Concentrado Enzimático Precipitação Moléculas Proteicas Centrifugação

28 Purificação Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. solventes (etanol, metanol) (NH4)2SO4 Concentrado Enzimático Precipitação Moléculas Proteicas Centrifugação

29 Purificação Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação. solventes (etanol, metanol) (NH4)2SO4 Concentrado Enzimático Precipitação ultrafiltração, microfiltração e osmose inversa Moléculas Proteicas Centrifugação

30 Purificação Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, técnicas cromatográficas são empregadas Cromatografia de Troca Iônica Carga das Moléculas Cromatografia de partição ou de filtração em gel Tamanho da Moléculas Ligação bio-específica da enzima com os ligantes (substratos ou inibidores) Cromatografia de Afinidade

31 Purificação A concentração pode ser obtida das seguintes formas:
Purificação por Cromatografia Concentração Poros pequenos. Remove cerca de 70% da H2O Adição de um polímero tipo Sephadex G-25 Remoção do solvente por membrana semi-permeável Ultrafiltração Remoção de água sob vácuo Liofilização

32 Purificação Controle de Pureza: Eletroforese.
Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas com a aplicação de uma diferença de potencial As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga. Das muitas técnicas de análise de proteínas, a eletroforese em gel é a + versátil e facilmente aplicável, é tão sensível que se podem detectar proteínas que só diferem em um aa.

33 Purificação O grau de purificação almejado esta relacionado à aplicação do produto. No mercado estão disponíveis: Preparações pouco purificadas, para uso técnico ou industrial; Preparados de alto grau de pureza para uso analítico ou farmacêutico.

34 Purificação

35 Produção Industrial de Enzimas
Caldo Fermentado Enzima Intracelular Enzima Extracelular Separação sólido/líquido Separação sólido/líquido Rompimento Celular Precipitação Ác. Nucléicos Concentração Concentração Purificação

36 Produção Industrial de Enzimas
Benefícios ambientais de trabalhar com enzimas: - São produzidas de fontes renováveis. - São completamente degradáveis. - Propiciam economia de energia, água, (condições brandas de temperatura, pH e pressão minimizando a degradação térmica dos produtos finais).