Marcadores Moleculares

Apresentação em tema: "Marcadores Moleculares"— Transcrição da apresentação:

1 Marcadores Moleculares
Até meados da década de 60  Marcadores morfológicos de fácil identificação Ex.: características das ervilhas de mendel; nanismo; deficiência clorofítica etc. MARCADORES MOLECULARES: todo fenótipo molecular oriundo de um gene expresso, ou de um segmento específico de DNA; a sequência de nucleotídeos e a função de um marcador molecular podem ou não ser conhecidas; ao se verificar o seu comportamento de acordo com as leis básicas de herança de Mendel, um marcador molecular é adicionalmente definido como marcador genético. Isoenzimas grupo de múltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre em uma espécie, como resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas; diferenças na mobilidade de isoenzimas em um campo elétrico são resultantes de diferenças nas sequências de DNA que codificam tais enzimas; co-dominante, ou seja, genótipos heterozigotos e momozigotos de um determinado loco são facilmente identificados. Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Ex. Anemia Falciforme - a hemoglobina de pessoas saudáveis e com anemia movem-se para posições diferentes - Ácido glutâmico  Valina Vantagens Desvantagens técnica barata e acessível co-dominantes poucos locos; baixo polimorfismo por loco; limitada a regiões transcritas; material deve ser fresco; influencia das condições ambientais; estágios diferentes de desenvolvimento; dificil interpretação dos zimogramas; Marcadores Moleculares

2 RFLP – “Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição”
DNA de indivíduos distintos difere na sequência de nucleotídeos ao longo da fita; a presença ou ausência de sítios de restrição pode variar entre indivíduos; inserções/deleções/inversões na sequência de DNA de diferentes indivíduos podem alterar a distância entre pares de sítios de restrição. Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Marcadores Moleculares

3 Cascatas de regulação da expressão gênica
Ex. 1 – Anemia Falciforme Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Ex. 2 – Fibrose Cística Alelo Normal: NH2 – Leu-Glu-Asn-Ile-Ile-Fen-Gli-Val-COOH Alelo F508: NH2 – Leu-Glu-Asn-Ile-Ile Gli-Val-COOH Vantagens Desvantagens nº de locos praticamente ilimitado; nivel de polimorfismo > isoenzimas co-dominantes; sondas de cDNA ou não PCR facilitou muito muito laboriosa (melhorou com PCR); necessidade de sondas disponíveis; manuseio de material radioativo; Marcadores Moleculares

4 RAPD – “Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso”
Geração de marcadores baseado na técnica de PCR; utiliza um primer único relativamente curto (10 nucleotídeos); primer único com sequencia arbitrária, portanto, sua sequência alvo é desconhecida; duas sequências complementares ao primer arbitrário devem estar próximas (<4000pb) e em orientação oposta. Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Marcadores Moleculares

5 Ex. 1 – “Fingerprint” para duas variedades de Uva
Ex. 2 – Detecção de RFLP em fragmentos monomórficos RAPD Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Vantagens Desvantagens técnica muito simples e barata; nº de locos praticamente ilimitado; alto nível de polimorfismo; quantidade mínima de DNA necessária; cobertura de todo o genoma. Dominante; difícil interpretação de algumas bandas; baixa reprodutibilidade; Marcadores Moleculares

6 AFLP – “Polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado”
geração de marcadores baseado na técnica de PCR; combina a especificidade e resolução da digestão com enzima de restrição com a velocidade e praticidade da PCR; consiste em 4 estapas principais: a) DNA genômico total é clivado com 2 enzimas de restrição; b) adaptadores específicos são ligados aos terminais gerados pelas enzimas de restrição; c) uma fração dos fragmentos gerados é amplificada via PCR utilizando primers que reconhecem as sequências dos adaptadores; d) a população de fragmentos amplificados é separada em géis de alta resolução. Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Vantagens Desvantagens grande número de locos analisados; Extremamente polimórfico; quantidade mínima de DNA necessária; maior robustez quando comparado ao RAPD; cobertura de todo o genoma. Dominante; Exige um grande número de etapas; DNA deve ser mais puro; marcação radioativa Marcadores Moleculares

7 SSR (“Sequencias simples repetidas” ou “Microssatélites”)
consistem de pequenas sequências, com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem: Ex: (GA)n, (TG)n, (AGC)n, etc. já foram descritos no nDNA, cpDNA e mtDNA; polimorfismo devido ao “escorregão” natural da polimerase Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Marcadores Moleculares

8 Um único locos SSR pode apresentar mais de 50 alelos...
Detecção de SSR em gel ou sequenciador... Cascatas de regulação da expressão gênica Os processos de diferenciação celular envolvem a participação de genes reguladores chave que controlam a expressão de genes específicos para a formação de cada órgaão ou tecido. Dentre os genes ativados, existem alguns que tb possuem afç de ativar outros genes. Genes constitutivos – expressos na maioria das células. São responsáveis pela pela manutenção de fçs essencias. Genes regulados – expresso em fases do desenvolv, em resposta a estímulos ambientais, etc. genes induzíveis genes tecido-específicos Multiplex... Vantagens Desvantagens hipervariáveis co-dominantes cobertura de todo o genoma; baseados em PCR; grande trabalho para desenvolvimento prévio dos marcadores (biblioteca de SSR) Exige marcação radioativa ou uso de sequenciador automático Marcadores Moleculares