TUBERCULOSE NA ERA PÓS GENÔMICA

Apresentação em tema: "TUBERCULOSE NA ERA PÓS GENÔMICA"— Transcrição da apresentação:

1 TUBERCULOSE NA ERA PÓS GENÔMICA
CURSO NACIONAL DE ATUALIZACAO EM PNEUMOLOGIA 19 A 21 DE ABRIL DE 2007 SÃO PAULO - SP TUBERCULOSE NA ERA PÓS GENÔMICA AFRANIO LINEU KRITSKI Programa Acadêmico de Tuberculose Faculdade de Medicina da UFRJ

2 Controle da TB em nível mundial – 2006-2015
ESTRATÉGIA DOTS NAO É SUFICIENTE Incidência da TB está AUMENTANDO em áreas de elevada taxa de HIV, MDR e nas metrópoles Necessário implementar pesquisa p/ aumentar a efetividade do tratamento com uso de novos fármacos (Regime 6 para 2 meses) a detecção precoce de TB ativa e latente (uso de novas técnicas diagnósticas e/ou de novas intervenções no Sistema de Saúde) o conhecimento da patogenicidade/bacilo e desenvolver novas vacinas

3 Tendência da incidência de TB em nível mundial
1990–2004 Incidence per 100,000 Year WHO Report Global tuberculosis control. WHO/HTM/TB/

4 Prevalência de Infecção pelo HIV entre casos de TB em nível mundial
HIV prevalence in TB cases, years (%) 0 - 4 5 - 19 50 or more No estimate The boundaries and names shown and the designations used on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. Dotted lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement.  WHO All rights reserved

5 Taxas de TBMR entre os casos novos de TB
3 – 6 % No estimate > 6% < 3% TB – multirresistente primária The boundaries and names shown and the designations used on this map do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of the World Health Organization concerning the legal status of any country, territory, city or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. Dotted lines on maps represent approximate border lines for which there may not yet be full agreement.  WHO All rights reserved

6 Tuberculose multirresistente  TB-MDR
Definição: cepas resistentes a rifampicina e a isoniazida. Emergiram na década de nos EUA e Europa. No inquérito de 1996 no Brasil  TB-MDR primária 1% excluiu os soropositivos e população de risco. Estudo global entre (58 regiões)  > 3% dos casos novos. “hot spots” Estônia (14,1%) China (10,8%) Letônia (9%) Ivanovo Oblast (9,0%) Iran(5%) Moçambique(3,5%) India(3,4%) Estudo global entre (77 países)  Europa Oriental e Ásia Central com 14% dos casos novos. 79% dos casos são resistentes a pelo menos 3 fármacos OMS,2004

7 Tuberculose multirresistente  TB-MDR (continuação).
O RISCO PARA TB-MDR - usuários de drogas intravenosas (OR 4,68) - desabrigados (OR 2,55) -viver em clínica de repouso (OR 2,05) - tuberculose anterior (OR2,03) - prisões (OR 2,02) - ser contato de paciente com TBMDR (OR 2,01) - imunossupressão sem HIV (OR 1,96) - AIDS (OR 1,96) - trabalhador na área de saúde (OR 1,77) OR: odds ratio (razão de chance) Estudo em 4 países da União Européia. Casal et al.,2005

8 Taxa de notificação de TB em grandes áreas Metropolitanas América Latina - 2004
Área Metropolitana Taxa de incidência /100,000 TB/HIV TB-MDR País Metropi Metrop Bnos. Aires 27 42,5 Não há vigilância Sistemática ?? 70% Río de J. Cidade 45,2 114,3 8% 11.2% 42,6% São Paulo 59,7 19,5% 17,1% Lima e Callao 108, 192,3 85% Montevideo (1997) 18,8 26,3 Não vigilância Sistemática ND OPAS

9 Técnicas moleculares e suas contribuições
no controle da TB Filogenia (SNPs, RDs, etc) Determinar distribuição geográfica de cepas (Spoligotyping, etc). Estudo da dinâmica de transmissão (RFLP, MIRU?) (Investigação de surtos, desvendar cadeia de transmissão, conhecer a transmissão populações específicas, identificar fatores e grupos de risco) Diferenciar reinfecção exógena de reativação/infecção policlonal (RFLP, DR-PCR) Detectar contaminação laboratorial (RFLP, DR-PCR) Detectar precocemente a TB por técnicas Amplificação Ácidos Nucléicos (i.e.: PCR) Monitorar transmissão de cepas multirresistentes (Innolipa, GenotypeMTBDR)

10 Elementos/Eventos genéticos identificados em
M.tuberculosis - bases das ferramentas moleculares. Seqüências repetitivas DRs - Spoligotyping  “Single –nucleotide polymorphisms” SNPs  Regiões de Deleção (RDs)  Seqüências de inserção - RFLP-IS6110  Elementos repetitivos de regiões intergênicas-MIRU-VNTR

11 A importância de estudos populacionais de genotipagem
e caracterização integral dos genomas. “Single –nucleotide polymorphisms” SNPs polimorfismo de base única no gene katG códon 463 (Leu463Arg) e no códon 95 (Thr95Ser) do gene gyrA  três grupos genéticos principais (PGG) Grupo 1 katG códon 463 CTG (Leu) e gyrA códon 95 ACC (Thr)  Ancestrais Grupo 2 katG códon 463 CGG (Arg) e gyrA códon 95 ACC (Thr) )  LAM  Grupo 3 katG códon 463 CGG (Arg) e gyrA códon 95 AGC (Thr) ) Sreevatsan et al,1997

12 Visão evolucionária proposta por Sreevatsan, 1997.

13 A contribuição da conhecimento das deleções no
genoma de M.tuberculosis Seqüênciamento de M.tuberculosis e M.bovis - comparação genômica Identificação de regiões de deleção/inserção Ex: 10 regiões deletadas (RD1-RD10) em M.bovis- Pasteur estão presentes na cepa H37Rv  dentre 7 regiões de deleções (RD4-RD3) em M.bovis verificou-se que RD1-RD3 são específicas  as regiões RD9 são exclusivas de M.africanum

14 Esquema evolucionário proposto por Brosh et al, 2002
 Estirpes modernas M.tb evoluiu em paralelo ao M.bovis Grupo 1 Grupo Grupo3

15 ESTUDOS DA DINÃMICA DA TRANSMISSÃO DE TB
Método padrão ouro de genotipagem RFLP – IS6110 (cepas cluster)

16 “Mycobacterial Interspead Repetitive Units” MIRU-VNTR:
Amplificação por PCR de elementos repetitivos dispersos em regiões intergênicas . Repetições possuem 40 a 100pb e variam em número de repetições e comprimento(VNTRs). 12 loci e 15 loci. Manualmente seguida por gel de eletroforese ou automatizado. Técnica mais fácil de realizar que o RFLP. Mas ainda não é considerada padrão ouro para análise de cluster no contexto clínico-epidemiológico

17 O método de genotipagem pelo MIRU-VNTR:
Posição dos 41 MIRU-VNTR no cromossomo do M. tuberculosis H37Rv. O primeiro número indica a posição de cada lócus ocupado por um MIRU-VNTR. A letra c indica orientação contraria a estabelecida por Cole et al, em Algarismos romanos indicam o tipo de MIRU (I, II ou III). Os números seguintes indicam a localização de cada loci. A esfera em preto indica os 12 loci com número variável de MIRU-VNTR.

18 Reinfecção exógena de pacientes HIV. Tipagem por DRE-PCR e RFLP
Uso de técnicas moleculares para confirmar reinfecção com nova cepa Mtb, mesmo em países em desenvolvimento Reinfecção exógena de pacientes HIV. Tipagem por DRE-PCR e RFLP Lourenço et al no Brasil e Warren R, 2005 na Africa do Sul

19 Países desenvolvidos – Década de Fatores de risco para agrupamento genotípico (“cluster”) – INFECÇÃO RECENTE Atendimento anterior em Hospital sem biossegurança Institucionalização prévia (prisão) HIV e estágio Idade Drogadição Resistência Doença cavitária Small et al, 1994; Tabet et al., 1994; Shafer et al., 1995; Ferrazoli et al., 2000 Diaz et al., 2001; Mc Conkey et al., 2002; Tudó et al., 2001; Barnes et al., 1997; French et al., 1998; Lockman et al., 2000

20 Estudos de epidemiologia molecular - Novo Milênio
“Spoligotyping” RFLP Alguns genótipos de Mtb: se disseminam com maior rapidez são mais virulentas mais associadas com falências e recidivas Daley CL. Clin Chest Med 26 (2005) 217 – 231 Bjune G, Clin Exp Immunol Sep;145(3):389-97

21 Estudos que avaliaram distribuição de cepas W/Beijing
Na América Latina, não há dados a respeito dos resultados do tratamento anti-TB; associaçao com fatores genotipicos das cepas M. tb; frequência de mutações dos genes de resistência Foi descrito associação de surtos MDR em hospitais e prisões Relevância: Identificar marcadores geneticos associados a resistencia a drogas, doença, falência tratamento= desenvolvimento novos testes de identificação simples e rápidos

22 “Spoligotyping” Estrutura das DR no  genoma das micobactérias B. Amplificação das DR por PCR  C. Padrões de hibridização spoligo-tipos  Kamerbeek et al, 1997

23 “Spacer oligonucleotide typing” Spoligotyping
Baseado no locus “direct-repear” DRcópia única com 10 a 50 repetições de DR com 36pb separadas por seqüências espaçadoras 37 a 41 pb (PCR + Hibridização reversa)  Principais famílias/sub-famílias do Complexo M. tuberculosis: East African and Indian”-5 sub-famílias Haarlem – 3 sub-famílias Middle Eastern Asian -2 sub-famílias ”T”, “S”, “X” Latin America and Mediterranean” (LAM) - 10 sub-famílias Beijing (sub-tipo antigo e moderno)

24 Distribuiçao de genótipo Beijing de tuberculose - 2005
Mutator gene mut, ogt >29,000 pacientes de 35 países Blue: stable, no drug resistance; Red: increasing, associated with drug resistance; Green: increasing, drug sensitive; Yellow: absent; Striped: trend and/or drug resistance not known

25 Relação entre TB resistente e W-genótipo Beijing em Archangel- Russia - 2005
Drobniewski F, JAMA 2005; 293 (22):

26 Virulência de M. tuberculosis em
camundongo BALB/c 8 genotype strains (2001) 17 genotype strains (2002) Em camundongo infectado com cepa Beijing: maior mortalidade maior n. de bacilos no pulmão menor produção de TNF + IFN menor proteção de vacinação com BCG Rad M.E. EID 2003; 9: Lopez B. Clin Exp Immunol 2003; 133:30-7.

27 Cepas resistentes a Isoniazida mais virulentas Análise molecular - Holanda

28 Transmissibilidade de cepa de M
Transmissibilidade de cepa de M. tuberculosis resistente Estudo populacional Holanda, 8334 pacientes, 59% estrangeiros todos os isolados: TSA, IS6110 RFLP determinação de katG315 de cepas INH resist 592 (7,1%) INH resistente 323 (54,6%) katG315 mutante 269 (45,4%) katG315 tipo selvagem Van Doorn HR, Clin Microbiol Infect (8):

29 Relação entre perfil katG315 com a ocorrência de agrupamento (cluster) entre cepas Mtb resistentes a INH Cluster Sim Não Odds ratio (95% CI) INHr 315wild 112 157 0.69 ( ) INHs 3922 3818 Ref 315mutant 163 160 0.99 ( ) Van Doorn HR, Clin Microbiol Infect (8):

30 The population structure of Mycobacterium tuberculosis in different geographic areas
Beijing genotype LAM; Haarlem LAM; Beijing Haarlem

31 Projects using spoligotyping
Phylogeny Spol DB3 (Institut Pasteur, Guadeloupe; Filliol et al. JCM 2003) (SpolDB4; Brudney et al. 2006) strains (+/- 150 Brazilian) (39.000) > 90 countries (140) population genetics, biogeographic distribution and phylogeny of Mtb Complex Rio: 400 patients >50% LAM 7% Haarlem 10% new LAM Only 2 Beijing Finetuning with MIRU-VNTR

32 MDR TB epidemic in Argentina: rise, decline, aftermaths
Buenos Aires Rosario Population Country: ,000,000 Buenos Aires: 11,000,000 Rosario: ,100,000 MDR TB outbreaks arose in the early ´90s in two overpolutated cities AIDS association Hospital setting Explosive transmission Rapid progression to disease Fatal outcome

33 Hospital Muñiz, Buenos Aires, 1991-2000
MDR TB outbreak Hospital Muñiz, Buenos Aires,

34 Profile of outbreak MDR TB strains
City Number of cases in SubLineage katG 315 1995 2005 M Buenos Aires 150 51 Haarlem 2 mut Ra Rosario 15 12 LAM3 Rb 8 6 T1 (Tuscany) wild C 1 T5 Análise molecular demonstra a epidemia por TB-MDR de cepas Mtb tipo Haarlem 2 na Argentina

35 Papel de outros genótipos de M
Papel de outros genótipos de M.tuberculosis em países em desenvolvimento ? Genótipo Beijing infrequente na America Latina (<5%) Escassos dados sobre surtos de TB, resistência as drogas analisados com ferramentas moleculares Genótipo Haarlem também apresenta mutator gene e pode estar associado com maior virulência e/ou desenvolvimento de resistência

36 Sympatric - allopatric
Interações diferentes do bacilo com hospedeiro Homem ??

37 Diagnóstico da Tuberculose

38 Nucleic Acid Amplification Trials

39 Métodos Diagnósticos Validados APENAS para: 1. amostras respiratórias
Amplificação de Ácidos Nucleicos (AAN) Kits commerciais E-MTD assay (Gen Probe Inc) aprovado pelo FDA: baar (-) (+) AMPLICOR MTB kit (Roche )* LC x Probe System (Abbot)* Strand Displacement Amplification* * aprovados pelo FDA para escarro baar (+) Validados APENAS para: 1. amostras respiratórias 2. pacientes adultos, 3. HIV soronegativos, 4. não tratados para TB LCx® Mycobacterium tuberculosis Assay Cobas Amplicor™ Mtb Test

40 Métodos Genotípicos Fenotípicos
Métodos de detecção da resistência Métodos Genotípicos Fenotípicos DNA Heteroduplex Proporções (Canetti et al1963)  SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism) Automatizados Bactec 460-TB, MGIT 960 Line Probe Assay (INNO-Lipa Rif TB)** LRP - Luciferase Report Phage Teste Hain p/ INH e RIF ** E-test Sequenciamento de DNA MIC (MABA,MTT, etc.) * Padrão ouro; ** Comercializados na Europa

41 Molecular MDR screening with line probe

42 Comparison GenoType® MTBDR and INNO-LiPA Rif.TB
Company Hain Lifescience Innogenetics M. tub detection Yes yes Detection of RMP Resistance of M. tub Complex Detection Isoniazid Resistance of M. tub Complex no Strip Assay DNA-Basis: PCR Culture requested Direct assay No yes (modified version M. tub-Komplex Detection: 23S-rRNA/16S-rRNA RMP-Resistance: rpoB gene INH-Resistance: katG gene Universalcontrol rpoB unicontrol kat G unicontrol

43  Desenvolvimento de novos fármacos e regimes terapêuticos
Prioridades para pesquisa e investimento em Tuberculose – 2006 OMS, UNICEF, Banco Mundial, Universidades de Harvard e da Zâmbia Fonte: Lancet 367:940-42; march 2006 Melhorar o diagnóstico: otimizar os métodos existentes e implementar novos sob modelo de custo-efetividade  Desenvolvimento de novos fármacos e regimes terapêuticos  Remodelar estratégias de tratamento  Pesquisa social e agenda global: reduzir o risco e a vulnerabilidade  Capacitar unidades para ensaios clínicos

44 PORQUE?? Nosso paciente com TB nao conta com novas tecnologias, como
outras pacientes com Hepatite B, C HIV Doenças Cardíacas Doenças Renais PORQUE??

45

46 Cidade do Rio de Janeiro
Obrigado

47 OBRIGADO PELA ATENÇÃO