METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN

Apresentação em tema: "METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN"— Transcrição da apresentação:

1 METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN
V Encontro Nacional de Vigilância Sanitária em Alimentos 31 de agosto a 04 de setembro de 2009 Goiânia - GO METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN Instituto Adolfo Lutz Divisão de Bromatologia e Química Serviço de Alimentos Seção de Doces e Amiláceos Rejane Weissheimer de Abreu

2 Por que da ADVERTÊNCIA nos rótulos dos alimentos, em relação à presença ou ausência de glúten
RWA

3 proteína do trigo = Glúten = glutenina + gliadina
DOENÇA CELÍACA Intolerância às proteínas provenientes do trigo, centeio, aveia e cevada proteína do trigo = Glúten = glutenina + gliadina Pro-Ser-Gln-Gln-Pro Frações proteícas solúveis em álcool PROLAMINAS TRATAMENTO Alimentação totalmente isenta de glúten RWA

4 LEGISLAÇÃO Lei Federal nº 8543/1992
Determinou a impressão de advertência em rótulos e embalagens de alimentos industrializados que contenham glúten ou apresentem em sua composição trigo, centeio, malte, cevada, aveia e/ou seus derivados. Resolução RDC nº 40/2002 Estendeu a obrigatoriedade da advertência “CONTÉM GLÚTEN” em caracteres com destaque, nítidos e de fácil leitura também as bebidas embaladas. Lei nº /2003 Obriga as inscrições “CONTÉM GLÚTEN” ou “NÃO CONTÉM GLÚTEN” para os produtos alimentícios comercializados, como medida preventiva e de controle da doença celíaca. RWA

5 IMPLANTAÇÃO Implantação de métodos analíticos sensíveis e específicos para detecção de glúten em alimentos. Testes Imunológicos Parceria BQ e BM Projeto FAPESP Objetivo: desenvolver metodologia Comparação ELISA in house x kit comercial ω gliadina RWA

6 ELISA RWA

7 EQUIPAMENTOS Equipamentos básicos: balança, pHmetro, agitador de tubos (PHOENIS), agitador orbital (FANEM), misturador digestor de líquidos (HEIDOLPH) e centrífuga (CELM) RWA

8 Multiskan Ascent - Labsystems
Lavadora de placas Wellwash 4 – Labsystems Leitora de placas Multiskan Ascent - Labsystems RWA

9 RWA

10 PADRÕES DE CONTROLE Glúten de trigo (gluten from wheat) SIGMA –– G5004
Gliadina (Gliadin): SIGMA – G-3375, RWA

11 TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320
KITS TRANSIA PLATE PROLAMINS DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320 RIDASCREEN® GLIADIN R BIOPHARM - Art. N◦ R7001 RWA

12 Amostras do teste de gliadina: controle negativo, controle A e controle B (positivas)
RWA

13 KIT PARA ELISA COMPOSIÇÃO: ω GLIADINA e R5
Placa de microtitulação com 12 tiras (96 alvéolos) sensibilizada com: * anticorpo anti-ω gliadina (ω gliadina) * pentapeptideo (R5) Padrão de gliadina liofilizada e padrões prontos Controles alto, médio e baixo Conjugado peroxidase anti-gliadina (peroxidase ligada a anticorpo monoclonal de rato Anti-ω gliadina) diluído em PBS Substrato TMB concentrado (tetrametilbenzidina) Solução de lavagem concentrada (tampão Tris-salino) Solução diluente concentrada (PBS com gelatina e timerosal) Solução finalizadora (ácido fosfórico 25%). RWA

14 DOT ELISA NA DETECÇÃO DE GLIADINA
B C D E F G H Linhas A – H: Diluição seriada ½ . Colunas: 1) Curva-padrão gliadina; 2, 3 e 4) Padrões glúten 3000, 400 e 160ppm; 5) Amostra FAPAS; 6) Sopa de feijão com macarrão; 7) Grão de cevada; 8, 9 e 10) Amido de milho, sopa de vegetais e Arroz - controle negativo RWA

15 CODEX ALIMENTARIUS Alimento naturalmente sem glúten até 20ppm
Mistura de alimentos naturalmente sem glúten até 100ppm RWA

16 DETECÇÃO DE GLIADINA EM ALIMENTOS INDUSTRIALIZADOS
Dot ELISA DETECÇÃO DE GLIADINA EM ALIMENTOS INDUSTRIALIZADOS ND = Não detectável – Abaixo dos limites de quantificação (10ppm) RWA

17 VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA CADA ALIMENTO
DESAFIOS 1. Composição do alimento – diferença entre as matrizes quantidade e ingredientes do alimento interferem diretamente na quantificação do analito VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA CADA ALIMENTO 2. Procedência dos ingredientes 3. Diferentes respostas ente os kits Extração Padrão Referência RWA

18 Valor de consenso de glúten (mg/Kg) Intervalo satisfatório
Resultados de controle interlaboratorial FAPAS para Mistura de pão seco (2712B) e Misturas para bolo de chocolate (2733 A e B) Material teste /kit Valor de consenso de glúten (mg/Kg) Nº escores dentro [z]≤2 Nº total de escores % Intervalo satisfatório 2712-B R-Biopharm 35,4 21 23 91 22,7-48,2 Tepnel & Transia 131,9 15 19 79 84,4-179,4 2733-A 7,12 - 2733-B 173 26 29 90 Tepnel 61,1 5 83 Neogen 177 11 100

19 PRIORIDADES Profissionais capacitados Padrões Controles internos
Validação do método para os laboratórios Comprovação do resultado com outro método RWA

20 CONCLUSÃO TRABALHO INTEGRADO ELISA
FONTE DE GLIADINA DOS INGREDIENTES PCR SEQUENCIAMENTO TRABALHO INTEGRADO RWA

21 EQUIPE MULTIDISCIPLINAR
ALIMENTO IAL CVE CVS ANVISA CELÍACO EQUIPE MULTIDISCIPLINAR RWA

22 Obrigada ! RWA