Terapia gênica - Princípios gerais Modificação genética das células para produzir efeito terapêutico Ex vivo: modificação genética feita em células em.

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1 Terapia gênica - Princípios gerais Modificação genética das células para produzir efeito terapêutico Ex vivo: modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao pacienteEx vivo: modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao paciente In vivo: modificação feita diretamente no pacienteIn vivo: modificação feita diretamente no paciente Modificação genética das células para produzir efeito terapêutico Ex vivo: modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao pacienteEx vivo: modificação genética feita em células em cultura que são administradas ao paciente In vivo: modificação feita diretamente no pacienteIn vivo: modificação feita diretamente no paciente

2 Necessidade de Necessidade de – se conhecer o gene terapêutico (clonagem do gene) –método para liberar o gene na célula alvo Métodos mais promissores: transferência gênica através de adenovirus associado e lentivirius Métodos mais promissores: transferência gênica através de adenovirus associado e lentivirius Necessidade de Necessidade de – se conhecer o gene terapêutico (clonagem do gene) –método para liberar o gene na célula alvo Métodos mais promissores: transferência gênica através de adenovirus associado e lentivirius Métodos mais promissores: transferência gênica através de adenovirus associado e lentivirius Terapia gênica - Princípios gerais

3 Células alvo para introdução de genes Células humanas: hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, mioblastos, etc Células humanas: hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, mioblastos, etc Células xenogênicas: murinas, porcinas, bovinas, outros primatas, etc Células xenogênicas: murinas, porcinas, bovinas, outros primatas, etc –Desvantagens: transmissão de retrovírus e xenoosis (algumas desconhecidas) Células humanas: hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, mioblastos, etc Células humanas: hematopoéticas, fibroblastos, hepatócitos, mioblastos, etc Células xenogênicas: murinas, porcinas, bovinas, outros primatas, etc Células xenogênicas: murinas, porcinas, bovinas, outros primatas, etc –Desvantagens: transmissão de retrovírus e xenoosis (algumas desconhecidas)

4 Métodos para introdução do DNA alvo Virais Virais –Retrovírus –Lentivírus –Adenovírus –Adenovírus associado –Herpes simples Virais Virais –Retrovírus –Lentivírus –Adenovírus –Adenovírus associado –Herpes simples

5 LTR gag pol env Retrovirus (wild-type) DNA LTR LTR Target DNA LTRRetrovirus vector DNA Genome Packaging cell line Packaging Genome Product of expression cassette ProviralRNA ProviralDNA RT Integration Target cell Receptor Packagedretrovirusvector Transferência Gênica

6 Lentivirus (HIV-1) também codificam também codificam tat e rev genes regulatórios da expressão tat e rev genes regulatórios da expressão genes acessórios genes acessóriosVantagens promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo infectam células que não estão em duplicação infectam células que não estão em duplicação também codificam também codificam tat e rev genes regulatórios da expressão tat e rev genes regulatórios da expressão genes acessórios genes acessóriosVantagens promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo promovem transporte ativo do complexo através do nucleoporo infectam células que não estão em duplicação infectam células que não estão em duplicação

7 AdenovirusAdenovirus derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria dos adultos já foi exposta derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria dos adultos já foi exposta eficientes para transferência gênica eficientes para transferência gênica não se integram no genoma (episomal) não se integram no genoma (episomal) derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria dos adultos já foi exposta derivados de sorotipos comuns, os quais a maioria dos adultos já foi exposta eficientes para transferência gênica eficientes para transferência gênica não se integram no genoma (episomal) não se integram no genoma (episomal)

8 Genome Complementing cell line Adenovirusvector Genome Product of expression cassette Target cell Receptor Endosome Episomalaction Adenovirus (wild-type) DNA E1E3 Transferência Gênica Adenovirus vector DNA Expression cassette (Target DNA) E3

9 Adenovirus associado (AAV) Parvovírus humanos que requerem um adenovirus para mediar infecção Parvovírus humanos que requerem um adenovirus para mediar infecção Eficientes para transferência gênica Eficientes para transferência gênica Não há doença conhecida associada com infecção pelo AAV Não há doença conhecida associada com infecção pelo AAV Podem integrar o genoma aleatoriamente ou Podem integrar o genoma aleatoriamente ou Podem ter localização episomal Podem ter localização episomal Parvovírus humanos que requerem um adenovirus para mediar infecção Parvovírus humanos que requerem um adenovirus para mediar infecção Eficientes para transferência gênica Eficientes para transferência gênica Não há doença conhecida associada com infecção pelo AAV Não há doença conhecida associada com infecção pelo AAV Podem integrar o genoma aleatoriamente ou Podem integrar o genoma aleatoriamente ou Podem ter localização episomal Podem ter localização episomal

10 Métodos para introdução do DNA alvo Não-Virais Não-Virais – LIpofecção – Eletroporação – Precipitação com Fosfato de cálcio – Bombardeio de partículas Não-Virais Não-Virais – LIpofecção – Eletroporação – Precipitação com Fosfato de cálcio – Bombardeio de partículas

11 Plasmid with expression cassette (target DNA) Genome Product of expression cassette Target cell Endosome Episomalaction Fuse with plasma membrane Transferência Gênica Lipossomes

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14 Injeção direta de DNA em células alvo Injeção direta de DNA em células alvo –Ex: Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX Anemia - injeção IM do gene da eritropoetina Anemia - injeção IM do gene da eritropoetina Neoplasias - injeção no tumor : Gene p53 Neoplasias - injeção no tumor : Gene p53 Gene suicida Gene suicida Anti-sense Anti-sense Infusão ou implante de células geneticamente modificadas Infusão ou implante de células geneticamente modificadas Injeção direta de DNA em células alvo Injeção direta de DNA em células alvo –Ex: Hemofilia B - injeção IM do gene do fator IX Anemia - injeção IM do gene da eritropoetina Anemia - injeção IM do gene da eritropoetina Neoplasias - injeção no tumor : Gene p53 Neoplasias - injeção no tumor : Gene p53 Gene suicida Gene suicida Anti-sense Anti-sense Infusão ou implante de células geneticamente modificadas Infusão ou implante de células geneticamente modificadas

15 Regulatory Review Required for Gene Transfer Trials U.S. Comitê de Ética Local Comitê de Ética Local Comitê Local de Biosegurança Comitê Local de Biosegurança FDA FDA Recombinant DNA Advisory Committee, NIH Recombinant DNA Advisory Committee, NIHBrazil Comitê de Ética Local Comitê de Ética Local CONEP CONEP Comitê Nacional de Biosegurança Comitê Nacional de BiosegurançaU.S. Comitê de Ética Local Comitê de Ética Local Comitê Local de Biosegurança Comitê Local de Biosegurança FDA FDA Recombinant DNA Advisory Committee, NIH Recombinant DNA Advisory Committee, NIHBrazil Comitê de Ética Local Comitê de Ética Local CONEP CONEP Comitê Nacional de Biosegurança Comitê Nacional de Biosegurança

16 Terapia gênica para hemofilia Vantagens níveis > 2% efeito terapêutico níveis > 2% efeito terapêutico não é necessária regulação gênica refinada não é necessária regulação gênica refinada não é necessária expressão tecido específica não é necessária expressão tecido específica rFVIII ou rFIX comerciais já existem rFVIII ou rFIX comerciais já existem avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticos avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticosVantagens níveis > 2% efeito terapêutico níveis > 2% efeito terapêutico não é necessária regulação gênica refinada não é necessária regulação gênica refinada não é necessária expressão tecido específica não é necessária expressão tecido específica rFVIII ou rFIX comerciais já existem rFVIII ou rFIX comerciais já existem avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticos avaliação da eficácia é fácil : níveis plamáticos

17 Ensaios Clínicos Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos com plasmideo contendo F.VIII Ex vivo : transfecção de fibroblastos autólogos com plasmideo contendo F.VIII

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19 Transplante de fibroblastos autólogo Implantar células no omentum Implantar células no omentum Ex vivo pouco risco de transmissão para células germinativas Ex vivo pouco risco de transmissão para células germinativas Expansão clonal de uma célula risco mínimo de mutagenesis Expansão clonal de uma célula risco mínimo de mutagenesis Procedimento trabalhoso Procedimento trabalhoso Implantar células no omentum Implantar células no omentum Ex vivo pouco risco de transmissão para células germinativas Ex vivo pouco risco de transmissão para células germinativas Expansão clonal de uma célula risco mínimo de mutagenesis Expansão clonal de uma célula risco mínimo de mutagenesis Procedimento trabalhoso Procedimento trabalhoso

20 Ensaios Clínicos In vivo In vivo Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII injeção IM de AAV/hF.IX injeção IM de AAV/hF.IX infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX In vivo In vivo Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII Infusão EV de vetor retroviral expressando F.VIII Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII Infusão EV de vetor adenoviral expressando F.VIII injeção IM de AAV/hF.IX injeção IM de AAV/hF.IX infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX infusão na artéria hepática de vetor AAV/ F.IX

21 Hemofilia Hemofilia Administração do vetor bem toleradaAdministração do vetor bem tolerada Não houve formação de anticorposNão houve formação de anticorpos Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepáticaDetecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepática Risco de transmissão para células germinativas parece baixaRisco de transmissão para células germinativas parece baixa Administração do vetor bem toleradaAdministração do vetor bem tolerada Não houve formação de anticorposNão houve formação de anticorpos Detecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepáticaDetecção transitória do vetor em semem após infusão EV de retrovirus ou adenovirus em artéria hepática Risco de transmissão para células germinativas parece baixaRisco de transmissão para células germinativas parece baixa

22 HemofiliaHemofilia Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação biologicamente ativoOutros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação biologicamente ativo F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientesF.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientes Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até 4%)Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até 4%) Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento de até 11% nos níveis de F.IX.Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento de até 11% nos níveis de F.IX. Outros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação biologicamente ativoOutros tecidos além do fígado podem secretar fatores de coagulação biologicamente ativo F.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientesF.VIII administrado por métodos virais e não virais resultou em aumento transitório deos níveis de fator VIII (até 2%) em poucos pacientes Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até 4%)Transferência de FIX mediada por AAV em músculo esquelético resultou em expressão duradoura de F.IX, mas em níveis subterapêuticos ( até 4%) Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento de até 11% nos níveis de F.IX.Transferência de FIX mediada por AAV em fígado resutou em aumento de até 11% nos níveis de F.IX.

23 Ensaios Clínicos 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênica 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênica Desafios Desafios sustentar efeito sustentar efeito inibir resposta imune inibir resposta imune aumentar expressão do transgene aumentar expressão do transgene 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênica 41 pacientes hemofílicos submetidos à terapia gênica Desafios Desafios sustentar efeito sustentar efeito inibir resposta imune inibir resposta imune aumentar expressão do transgene aumentar expressão do transgene

24 Gene da Eritropoetina para tratamento de anemia Vetor não viral Vetor não viral injeção IM em camundongos injeção IM em camundongos estímulo elétrico estímulo elétrico Vetor não viral Vetor não viral injeção IM em camundongos injeção IM em camundongos estímulo elétrico estímulo elétrico

25 Hematócrito antes e após terapia gênica com gene da EPO EPO

26 O Sistema Tet-Off para controle da expressão gênica Doxociclina ou tetraciclina Ausência de transcrição TRETRE PCMV tetRtetRADAD transativador TRETREpCMVpCMV Gene alvo pCMVpCMV Presença de transcrição

27 Controle da expressão gênica pela administração de Doxociclina Doxociclina

28 Células Progenitoras Hematopoéticas Placenta Medula Óssea Sangue Periférico + fatores de crescimento Seleção CD34+ Crescimento in vitro Transferência gênica Infusão de células genéticamente alteradas

29 Correção de hemoglobinopatia anemia falciforme e talassemia (camundongos) anemia falciforme e talassemia (camundongos) Vetor: lentivirus Vetor: lentivirus Gene: beta-globina Gene: beta-globina Transferência do gene para células CD 34+ Transferência do gene para células CD 34+ Mieloablação e infusão das células modificadas Mieloablação e infusão das células modificadas anemia falciforme e talassemia (camundongos) anemia falciforme e talassemia (camundongos) Vetor: lentivirus Vetor: lentivirus Gene: beta-globina Gene: beta-globina Transferência do gene para células CD 34+ Transferência do gene para células CD 34+ Mieloablação e infusão das células modificadas Mieloablação e infusão das células modificadas

30 Correção de talassemia

31 Correção de doença falciforme * **

32 X-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OF THERAPEUTIC GENE TRANSFER X-LINKED SCID: FIRST EXAMPLE OF THERAPEUTIC GENE TRANSFER Lethal disease Lethal disease Caused by gc cytokine Caused by gc cytokine receptor deficiency receptor deficiency Curable by bone marrow Curable by bone marrow transplantation transplantation Lethal disease Lethal disease Caused by gc cytokine Caused by gc cytokine receptor deficiency receptor deficiency Curable by bone marrow Curable by bone marrow transplantation transplantation Cavazzana-Calvo et al. Gene therapy of human severe imunodeficiency disease. Science :288:669, 2000 Cavazzana-Calvo et al. Gene therapy of human severe imunodeficiency disease. Science :288:669, 2000

33 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocina 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocina –colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+) –introdução do gene alvo + retrovírus –reinfusão das células modificadas na corrente circulatória Resultado Resultado –expressão do receptor nas células do sangue periférico e nos linfócitos –os linfócitos passaram a funcionar –redução das infecções 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocina 2 crianças de 8 e 12 meses de idade com mutação da cadeia gama do receptor comum para citocina –colhidas células precursoras hematopoéticas (CD 34+) –introdução do gene alvo + retrovírus –reinfusão das células modificadas na corrente circulatória Resultado Resultado –expressão do receptor nas células do sangue periférico e nos linfócitos –os linfócitos passaram a funcionar –redução das infecções Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave

34 Terapia gênica para tratamento de deficiência de adenosina deaminase (ADA) Também causa imunodeficiência grave Também causa imunodeficiência grave 3 crianças com diagnóstico pré-natal 3 crianças com diagnóstico pré-natal colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+) colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+) introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus transplante autólogo transplante autólogo Resultado: melhora das infecções Resultado: melhora das infecções Também causa imunodeficiência grave Também causa imunodeficiência grave 3 crianças com diagnóstico pré-natal 3 crianças com diagnóstico pré-natal colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+) colhido sangue de cordão umbilical e separadas células precursoras (CD34+) introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)+ retrovírus transplante autólogo transplante autólogo Resultado: melhora das infecções Resultado: melhora das infecções LTRLTRLTRLTR c DNA Adenosina deaminase

35 Detecção de vetor ADA por PCR semiquantitativo Kohn et al, 1995, Nature Medicine

36 Retrovirus-mediated wild-type p53 gene transfer to tumors of patients with lung cancer J.A. Roth, et al Nature Medicine, Volume 2, Number 9, September 1996 Pretreatment (a and c) and 30 day posttreatment (b and d) bronchoscopic images

37 Terapia Anti-sense DNA alvo DNA anti-sense TranscriçãoTranscrição RNAm sense RNAm anti-sense Bloqueio da Tradução para proteína

38 Terapia Anti-sense Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996 ) Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996 ) –Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam bcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapia –6 injeções parenterais do antisense –Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4 pacientes com resposta parcial Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense) Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense) Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996 ) Atividade anti-linfoma com antisense BCL-2 (Webb et al, Ann Oncol, 7(suppl.3),32,1996 ) –Metodologia: 13 pacientes com linfoma que expressavam bcl-2, em recaída após vários esquemas de quimioterapia –6 injeções parenterais do antisense –Resultados: 1 paciente com resposta completa, 4 pacientes com resposta parcial Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense) Bcl-2 antisense oblimersen sodium (Genasense)

39 Produção de vacinas de tumor autólogo Ressecção e cultivo de células tumorais gene Imunoestimulação das células modificadas Testar expressão gênica Injetar células sc

40 Gene Suicida Ex: HSV - TK Ex: HSV - TK Herpes simples Timidina Quinase GanciclovirGanciclovir Fosforilação do Ganciclovir Morte celular

41 Células xenogênicas para terapia gênica Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor contendo o gene suicida timidina quinase + regiões do vírus herpes simples para tratamento de Tumor cerebral Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor contendo o gene suicida timidina quinase + regiões do vírus herpes simples para tratamento de Tumor cerebral Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga em droga. O herpes simples tem afinidade pelo sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o ganciclovir. O ganciclovir fosforilado destrói a celula Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga em droga. O herpes simples tem afinidade pelo sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o ganciclovir. O ganciclovir fosforilado destrói a celula Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor contendo o gene suicida timidina quinase + regiões do vírus herpes simples para tratamento de Tumor cerebral Exemplo: Linhagem murina produtora de vetor contendo o gene suicida timidina quinase + regiões do vírus herpes simples para tratamento de Tumor cerebral Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga em droga. O herpes simples tem afinidade pelo sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o ganciclovir. O ganciclovir fosforilado destrói a celula Objetivo: induzir a transformação de uma pró-droga em droga. O herpes simples tem afinidade pelo sistema nervoso. A timidina quinase fosforila o ganciclovir. O ganciclovir fosforilado destrói a celula

42 Transferência de células produtoras de HSV-tk em Tumor Cerebral

43 Ram et al, 1997 - Nature Medicine 3:1354

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45 Segurança em Terapia Gênica Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Carboxilase (OTC) Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Carboxilase (OTC) Infusão em artéria hepática em adultos com doença leve ou heterozigotos Infusão em artéria hepática em adultos com doença leve ou heterozigotos Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg) Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg) Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Carboxilase (OTC) Vetor adenoviral expressando gene Ornitina Carboxilase (OTC) Infusão em artéria hepática em adultos com doença leve ou heterozigotos Infusão em artéria hepática em adultos com doença leve ou heterozigotos Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg) Setembro 1999, paciente com doença leve recebeu altas doses de vetor ( 6x1011 vp/kg) Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos Desenvolveu febre, falência de múltiplos órgãos

46 Em 2002 Em 2002 11 pacientes em tratamento com boa resposta: melhora da imunodeficiência 11 pacientes em tratamento com boa resposta: melhora da imunodeficiência –4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide aguda (2002, 2003, 2004) –Interrupção do protocolo Pacientes com imunodeficiência teriam menos chance de rejeitar células neoplásicas?? Pacientes com imunodeficiência teriam menos chance de rejeitar células neoplásicas?? Em 2002 Em 2002 11 pacientes em tratamento com boa resposta: melhora da imunodeficiência 11 pacientes em tratamento com boa resposta: melhora da imunodeficiência –4 pacientes desenvolveram leucemia mielóide aguda (2002, 2003, 2004) –Interrupção do protocolo Pacientes com imunodeficiência teriam menos chance de rejeitar células neoplásicas?? Pacientes com imunodeficiência teriam menos chance de rejeitar células neoplásicas?? Terapia gênica para tratamento de imunodeficiência grave

47 Toxicidade potencial da terapia gênica Relacionada ao vetor Relacionada ao vetor - resposta imune - integração Relacionada ao Transgene Relacionada ao Transgene - response imune - superexpression Transmissão para células germinativas Transmissão para células germinativas Relacionada ao vetor Relacionada ao vetor - resposta imune - integração Relacionada ao Transgene Relacionada ao Transgene - response imune - superexpression Transmissão para células germinativas Transmissão para células germinativas

48 Segurança em terapia gênica Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar em genes ativos (exons) Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar em genes ativos (exons) –Schroder et al (Cell, 2002) –Nakai et al (Nature Genetics, 2003) Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar em genes ativos (exons) Lentivirus e AAV têm maior chance de se integrar em genes ativos (exons) –Schroder et al (Cell, 2002) –Nakai et al (Nature Genetics, 2003)

49 ConclusãoConclusão Terapia gênica é uma realidade Terapia gênica é uma realidade

50 AgradecimentosAgradecimentos Margareth Castro OzelloMargareth Castro Ozello Valder R.ArrudaValder R.Arruda Marcelo Agostinho SalomãoMarcelo Agostinho Salomão Denise Silvia SouzaDenise Silvia Souza Dilmara Lopes VicentimDilmara Lopes Vicentim Margareth Castro OzelloMargareth Castro Ozello Valder R.ArrudaValder R.Arruda Marcelo Agostinho SalomãoMarcelo Agostinho Salomão Denise Silvia SouzaDenise Silvia Souza Dilmara Lopes VicentimDilmara Lopes Vicentim