Clonando o metagenoma do solo: uma estratégia para o acesso à diversidade genética e funcional de microrganismos não cultivados.

Apresentação em tema: "Clonando o metagenoma do solo: uma estratégia para o acesso à diversidade genética e funcional de microrganismos não cultivados."— Transcrição da apresentação:

1 Clonando o metagenoma do solo: uma estratégia para o acesso à diversidade genética e funcional de microrganismos não cultivados

2 Introdução Diversidade de microrganismos
Métodos tradicionais de cultivo Conceito de METAGENOMA Importância e utilidade dos microrganismos Acesso ao DNA metagenômico do solo Uso de cromossomos artificiais de bactéria (BAC)

3 Características: mantém insertos de grande extensão de DNA (> 100 kb) apresenta poucas cópias (1 ou 2 por célula) pode ser utilizado para expressar o DNA exógeno

4 Objetivo Avaliar a diversidade microbiana no ambiente através da extração e análise do DNA metagenômico

5 Materiais e Métodos Linhagens de bactérias e plasmídeos:
- Escherichia coli DH10B - BAC pBeloBAC11 - Bacillus subtilis BR151(pPL608) Extração de DNA do solo: - coleta do solo (Estação de pesquisa em Agricultura – Madison, Wis)

6 Materiais e Métodos Extração de DNA do solo:
- 5g suspendidas em 10 ml de tampão - Incubação a 60°C por 2 hs - Extração do DNA com clorofórmio e precipitação com isopropanol - Dissolução em água (500 μl) - Eletroforese em gel de agarose - Armazenamento em TE + poliaminas overnight OBS: em numerosos experimentos esta metodologia produziu DNA de tamanho e limpeza apropriados para a clonagem subseqüente

7 Materiais e Métodos Construção das bibliotecas SL1 - SL1 e SL2
- DNA X Gelase - Preparação do vetor - Digestão do DNA com Hind III - Ligação - Transformação URL Rondon et. al (1999)

8 Materiais e Métodos SL2 - Preparação do vetor (digestão, ligação, gel, seleção e eluição) - DNA metagenômico: eletroforese do tipo pulsed-field (> 50 kb) - Digestão com Hind III e eletroforese (insertos  40 kb) - Ligação - Transformação - Armazenamento

9 Materiais e Métodos Amplificação por PCR, clonagem e seqüenciamento de genes ribossomais 16S da SL1 - PCR: 48 conjuntos de clones (primers específicos + oligonucleotídeo competitivo) - Clonagem - Seqüenciamento (ABI modelo 377) Seleção de clones - SL1 testes para a detecção da atividade das seguintes enzimas: -lactamase, celulase, protease, queratinase, quitinase, lipase, esterase, amilase e Dnase DH10B/pBeloBAC11 (controle -) e linhagens ou enzimas purificadas (controle +)

10 Materiais e Métodos Seleção de clones
- SL2 testes para a atividade hemolítica OBS: Todos os clones com resultados positivos foram testados novamente Seleção de atividade antibacteriana - colônias incubadas com B. subtilis BR151(pPL608)

11 Resultados SL1 SL2 - 3.648 clones arranjados em 38 placas de 96 poços
- 100 Mb - 2% dos clones (n  8) foram analisados - 97% contém um inserto de DNA (27 kb) SL2 clones em 256 placas Mb - 132 (0,5%) clones foram analisados - tamanho médio dos insertos: 44,5 kb (60% > 40 kb) Considerando-se que em média um gene apresenta 1 kb pode-se dizer que a SL2 contém 1 milhão de genes

12 Resultados Esses dados revelam que as melhorias feitas ao método original resultaram numa biblioteca com mais DNA metagenômico e com maiores insertos

13 Resultados Análise filogenética da SL1
Esses dados mostram que o método utilizado, pelos autores, para extração e clonagem de DNA recuperam o material genético de diversos procariotos, incluindo bactérias gram-positivas

14 Resultados Seleção da atividade biológica
- SL1 foram encontrados clones para: DNase (1) lipase (2) amilase (8) atividade antibacteriana (1) - Método que pode ser usado para extrair e identificar informações genéticas úteis de DNA de origem ambiental - SL2 foram identificados 29 clones para a atividade hemolítica

15 1 a 8 clones com atividade amilásica, 9 e 10, lipásica

16 Resultados Caracterização do clone antibacteriano SL1-36C7
- Atividade inibitória para B. subtilis, fracamente inibitória para Staphylococcus aureus e sem atividade contra E. coli - completamente seqüenciado

17 Discussão Os resultados mostram a possibilidade de clonar DNA ambiental em bibliotecas BACs mantidas em E. coli, uma metodologia que é independente de métodos de cultivo e pode ser utilizada em larga escala Esta técnica permite o estudo de propriedades filogenéticas, físicas e funcionais do metagenoma Além da avaliação da diversidade no ambiente, esta metodologia possibilita a descoberta de novos grupos de organismos