Bacilos Gram negativos não-fermentadores de glicose

Apresentação em tema: "Bacilos Gram negativos não-fermentadores de glicose"— Transcrição da apresentação:

1 Bacilos Gram negativos não-fermentadores de glicose
Keite Nogueira

2 Importância clínica As bactérias que compõem o grupo de BGN-NF são consideradas oportunistas. Têm grande importância clínica em casos de infecções relacionadas à assistência à saúde, principalmente em: - unidades de terapia intensiva; - pacientes submetidos a procedimentos invasivos; - unidades de queimados; - em infecções do trato respiratório de pacientes com fibrose cística (FC). A FC é uma doença genética grave, de herança autossômica recessiva, cuja principal manifestação clínica é a doença pulmonar obstrutiva crônica progressiva, freqüentemente associada a quadros infecciosos. A Pseudomonas aeruginosa é o BGN-NF que mais acomete estes pacientes, segundo a Cystic Fibrosis Foundation; infectam aproximadamente 60% da população com FC e 70% a 80% dos adolescentes e adultos. Muitas cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas de pacientes com FC apresentam o fenótipo mucóide, devido à produção de alginato. A presença desse fenótipo é indicativa de infecção crônica e está relacionada com um declínio da função pulmonar e pior prognóstico.

3 Importância clínica Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii estão entre as bactérias mais isoladas em hemoculturas e amostras do trato respiratório de pacientes sob regime de internação hospitalar. No entanto, os demais BGN-NF representam um percentual pequeno de isolados, quando comparados com outros agentes etiológicos, mas alguns deles apresentam resistência elevada a vários antimicrobianos (Complexo B. cepacia e S. maltophilia) e são capazes de causar infecções graves.

4 Importância clínica A prevalência de BGN-NF no trato respiratório de pacientes portadores de fibrose cística, tais como Complexo Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia e Achromobacter xylosoxidans subespécie xylosoxidans, tem aumentado nos últimos anos e pode evoluir como colonização persistente e sérios danos pulmonares. Infecções por alguns microrganismos do Complexo B. cepacia (B. cenocepacia, principalmente) podem levar à síndrome cepacia, caracterizada por rápido declínio da função pulmonar, febre alta, bacteremia e/ou septicemia, resultando em morte precoce. O número de BGN-NF é muito grande; portanto, foram selecionados os mais freqüentemente envolvidos em infecções que afetam os humanos.

5 Isolamento A amostra clínica deve ser enviada imediatamente ao laboratório clínico após a coleta. Em casos onde não é possível o envio ao laboratório em no máximo até 2 horas, manter a amostra refrigerada. Amostras coletadas em swab podem ser colocadas em meio de transporte tipo Cary-Blair. Amostras de sangue devem ser imediatamente inoculadas em frascos apropriados para hemocultura. A mostra de escarro muito viscoso deve ser previamente tratada com N-acetil-L-cisteína a 0,5%.

6 Isolamento Meios de cultura necessários para o primo isolamento:
- Ágar sangue; - Ágar MacConkey; Meios seletivos para amostras provenientes de pacientes com fibrose cística, tais como ágar B. cepacia e meios seletivos para Stenotrophomonas maltophilia. Observação: Os meios de cultura devem ser incubados entre 35ºC e 37ºC, em aerobiose por 24 a 48 horas. Geralmente apresentam bom crescimento, mas para a cultura de pacientes com FC, às vezes é necessário incubação por até 5 dias

7 Identificação Triagem inicial
As características das colônias após incubação devem ser observadas macroscopicamente quanto ao tamanho, forma, consistência, cor, produção de pigmento, presença ou ausência de reações hemolíticas em ágar sangue e presença ou ausência de crescimento em ágar MacConkey. Importante também observar o crescimento com 24 a 72 h de incubação, em meios Trypticase Soy Agar (TSA) e MacConkey, devido ao crescimento lento de alguns BGN-NF.

8 B. cepacea S. maltophilia

9 A. baumannii Shewanella spp.
Verificar a formação de pigmento em meio TSA das espécies de Shewanella spp. e P. aeruginosa. P. aeruginosa

10 Identificação          1. A partir de uma colônia isolada, em cultura pura com 24 a 72 horas de crescimento, proceder à semeadura em: Meio para diagnóstico presuntivo: Triple Sugar Iron (TSI), EPM - Mili ou IAL (Rugai modificado); Meio sem adição de corantes para verificar pigmento e manter o inóculo: Trypticase Soy Agar (TSA) inclinado ou ágar comum inclinado; Caldo para verificar o Gram e a motilidade em lâmina: Trypticase Soy Broth (TSB), ou caldo comum. 2. Incubar a 30ºC por 16 a 48 horas e em seguida realizar a coloração de Gram, oxidase e a motilidade em lâmina a fresco. 3. O crescimento pode ser observado até 72 horas pelo fato de alguns BGN-NF crescerem mais lentamente.

11 Identificação Semeadura, leitura e interpretação das provas para triagem inicial A - TSI ou IAL - Semear com agulha, picando até o fundo do tubo, e estriar a superfície do meio. - Leitura: TSI: meio permanece inalterado, vermelho (alcalino), no ápice e na base. IAL: meio inalterado e crescimento no ápice (pode ser observado pigmento).

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13 Identificação B - Oxidase - Umedecer um papel de filtro, colocado no interior de uma placa de Petri, com solução de oxalato de p-aminodimetilanilina a 1% (mais sensível que as tiras); - A partir do crescimento em TSA, esfregar uma alçada da massa bacteriana, no papel de filtro umedecido, com alça descartável ou de platina, pois a alça de níquel-cromo produz uma reação falso-positiva; - A leitura é feita em 15 segundos a 1 minuto. Oxidase positiva: cor púrpura forte que aparece rapidamente em menos de 15 segundos; Oxidase positiva lenta: reação fraca que aparece entre 15 segundos a 1 minuto. Pode ocorrer com Complexo Burkholderia cepacia e Stenotrophomonas maltophilia; Oxidase negativa: coloração inalterada do inóculo.

14 Identificação C - Motilidade - Colocar uma gota do caldo TSB ou outro caldo com crescimento bacteriano (16 a 48 horas a 30ºC) em uma lâmina nova; - A leitura tem que ser rápida porque os BGN-NF são aeróbios, portanto a sobrevivência dos mesmos na lamínula é curta. - Leitura: Motilidade negativa: movimentos vibratórios fracos ou ausência de movimento; Motilidade positiva: presença de bactérias cruzando o campo em diferentes direções, sugerindo flagelo polar, ou bactérias girando em torno de si mesmas, sugerindo flagelo peritríqueo. Motilidade negativa: movimentos vibratórios fracos (movimento browniano: quando o movimento bacteriano ocorre em uma única direção, indicando provavelmente o movimento do líquido entre lâmina e lamínula) ou ausência de movimento; Motilidade positiva: presença de bactérias cruzando o campo em diferentes direções, sugerindo flagelo polar, ou bactérias girando em torno de si mesmas, sugerindo flagelo peritríqueo.

15 Identificação D - Coloração de Gram - Observar a morfologia das células bacterianas, sua disposição e as suas características tintoriais

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17 Identificação Identificação bioquímica após a triagem inicial - A partir do tubo de TSA inclinado ou ágar comum, preparar uma suspensão bacteriana em solução salina 0,85% estéril, ou água destilada estéril, correspondente à escala 0,5 - 1,0 de McFarland. 1- OF ou MEVAG Semeadura: Inocular 2 a 3 gotas da suspensão bacteriana em: Tubo OF ou MEVAG (Meio para o Estudo da Via de Ataque aos Glicídeos) adicionados assepticamente com uma solução aquosa estéril de glicose com concentração final de 1%; Os tubos são conservados em banho-maria a 56ºC até o momento da inoculação bacteriana; Em um dos tubos adiciona-se assepticamente uma camada de vaselina líquida estéril, dando condições anaeróbias.

18 Identificação 2- Provas complementares: tubos OF ou MEVAG adicionados assepticamente com uma solução aquosa estéril de adonitol, inositol, lactose, maltose, manitol, sacarose, trealose e xilose (concentração final de 1%); 3- Tubos contendo os aminoácidos lisina descarboxilase e arginina de-hidrolase. Os tubos devem ser incubados em condições anaeróbias, colocando-se uma camada de óleo mineral ou vaselina líquida estéril sobre o caldo; 4- Caldo nitrato e caldo nitrato com tubo de Durhan invertido; 5- Pseudomonas ágar P (piocianina) e Pseudomonas ágar F (fluoresceína ou pioverdina); 6- Caldos TSB: incubar a 4ºC e 42ºC.

19 Identificação 7- ágar citrato de Simmons;
8- Utilizar os resultados do antibiograma para avaliar os discos de polimixina e imipenem; 9- A partir do crescimento bacteriano em TSA, utilizando a alça de níquel-cromo ou descartável, semear em: - Meio uréia-indol: inóculo denso; - Placa de ágar cetrimide, em estrias; - Inocular em forma de botão as placas contendo ágar DNase, ágar gelatina e ágar lipase; - Ágar esculina, fazendo estrias na superfície; - TSA com 1% de lactose, fazendo estrias na superfície. Após a semeadura, todos os meios são incubados a 30ºC por 16 a 24 horas, com exceção das placas de ágar Müeller-Hinton com os discos de polimixina e imipenem, que serão incubadas a 35ºC, e dos tubos de TSB para verificar o crescimento em diversas temperaturas.

20 Identificação MEVAG: Distinguem-se 3 tipos de bactérias:
Fermentativas: a acidificação é rápida e igual nos dois tubos (com e sem vaselina), tornando-os amarelos. Ocorre ou não a produção de gás. Oxidativas: moderada acidificação na superfície do tubo aberto (amarelo) e pouca ou nenhuma acidificação no tubo fechado (mantém a cor do meio). Inertes ou Alcalinas: pouca ou nenhuma acidificação no tubo fechado (mantém a cor do meio) e nenhuma acidificação ou uma alcalinização mais ou menos forte na superfície do tubo aberto (OF produz coloração azulada e MEVAG um rosa mais intenso).

21 Identificação Aminoácidos lisina, arginina: Os tubos testes devem ser comparados com o tubo controle negativo para interpretação dos resultados. A leitura pode ser realizada até 72 h, se não positivar antes. Reação positiva: intensificação da cor púrpura do meio: indica uma reação positiva devido à liberação de enzimas por descarboxilação / hidrólise com aumento de pH do meio. Reação negativa: o tubo mantém a cor púrpura original.

22 Identificação Redução de nitrato:
O teste é revelado através da adição de 3 gotas do reativo de Griss A com 3 gotas do reativo de Griss B no caldo nitrato. O desenvolvimento de uma coloração vermelha dentro de 1 a 2 minutos indica a presença de nitrito e, portanto, um teste positivo. Não ocorrendo a coloração vermelha: O nitrato não foi reduzido, ou O nitrato foi reduzido a nitrito e este, reduzido a gás nitrogênio livre. Nestes casos, adiciona-se uma pitada de zinco em pó. Se o nitrato ainda estiver presente, este será reduzido pelo zinco e uma coloração vermelha aparecerá dentro de 5 a 10 minutos, indicando que não houve a redução de nitrato a nitrito, portanto teste negativo. Se ocorrer a redução de nitrato a nitrito e este a nitrogênio livre, a cor não se altera. Nitrato com Durhan: Pode-se observar a produção ou não de gás no interior do tubo de Durhan invertido.

23 Identificação Pseudomonas ágar P e Pseudomonas ágar F:
Estes meios se destinam a favorecer a síntese da piocianina (ágar P) e da pioverdina ou fluoresceína (ágar F). A piocianina se manifesta corando o meio de cultura de azul-esverdeado, enquanto que a pioverdina o cora em verde fluorescente; Pseudomonas aeruginosa é a única espécie conhecida de bactéria que produz a piocianina; Fluoresceína ou pioverdina (F) pode ser produzida por P. aeruginosa, P. fluorescens e P. putida. Para confirmar a presença da piocianina, pode-se colocar de 1 mL a 2 mL de clorofórmio em contato com o meio de cultura. A piocianina é solúvel em clorofórmio e o meio torna-se azul. A pioverdina é um pigmento não solúvel em clorofórmio.

24 Identificação Caldo TSB para verificar o crescimento a 4ºC e 42ºC:
Reação positiva: ocorre a turvação do meio. Reação negativa: não se observa a turvação do meio.

25 Ágar citrato de Simmons:
O teste do citrato de Simmons é indicado para determinar a capacidade de certas bactérias de utilizarem o citrato como única fonte de carbono para o seu metabolismo; O ágar citrato de Simmons contém citrato de sódio como única fonte de carbono, fosfato de amônia como única fonte de nitrogênio e o azul de bromotimol como indicador de pH; Quando a bactéria utiliza o citrato, este é removido do meio e CO2 é liberado. O CO2 combina-se com o sódio, do citrato de sódio e água para formar carbonato de sódio, um produto alcalino. Isto aumenta o pH, mudando a cor do meio de verde (negativo) para azul (positivo).

26 Discos de polimixina e imipenem:
Polimixina: ausência do halo, Complexo Burkholderia cepacia é intrinsecamente resistente; Imipenem: ausência do halo, Stenotrophomonas maltophilia é intrinsecamente resistente.

27 Meio uréia-indol: Esse meio permite a pesquisa simultânea da urease e da produção de indol: A atividade da urease é detectada pelo crescimento da bactéria em meio contendo uréia e usando um indicador de pH, vermelho de fenol. Quando a uréia é hidrolisada, a amônia se acumula no meio e o torna alcalino. Ocorre aumento no pH, causando a mudança de cor no indicador de amarelo para rosa pink, indicando uma reação positiva.A ausência de mudança na coloração indica um teste negativo (Figura 17); O teste do indol determina a capacidade de certas bactérias que possuem a enzima triptofanase de degradar o triptofano, produzindo indol, ácido pirúvico e amônia. A presença de indol pode ser detectada pela adição do Reativo de Kovacs, ocorrendo a formação de um anel de coloração vermelho na superfície do meio, indicando uma reação positiva. A ausência de mudança de cor indica que o triptofano não foi hidrolisado e, portanto, a reação é negativa conforme observado na Figura 18.

28 Hidrólise da esculina:
O produto hidrolisado reage com o composto férrico do meio proporcionando um precipitado negro intenso nas provas positivas, podendo ser observado a partir de 6 horas de incubação até 48 horas; A coloração castanho-escura é considerada prova negativa; A cor é devida à produção de pigmentos por alguns BGN-NF.

29 Hidrólise da gelatina:
O teste determina a habilidade de um organismo produzir enzimas proteolíticas, a gelatinase que liquefazem a gelatina; No teste positivo, observa-se um halo leitoso ao redor do inóculo. Se houver dificuldade de visualização do halo, deve-se acrescentar 1 mL a 2 mL de reativo de Frazier ou HCl 1N, banhar a placa e retirar o reativo. Nota-se uma zona transparente ao redor do inóculo produtor de gelatinase

30 Identificação Hidrólise do Tween 80 – Pesquisa da lipase:
No teste positivo, observa-se uma zona de precipitação ao redor do inóculo.

31 Identificação Ágar DNase:
Teste para determinar a capacidade de um organismo produzir a enzima DNase, que é capaz de degradar o DNA; Este meio pode conter um corante metacromático denominado Azul de Toluidina O (TBO). Quando o DNA é hidrolisado, o TBO é complexado, resultando numa coloração pink ao redor do inóculo, determinando uma reação positiva; Nos meios que não contêm o corante, deve-se adicionar HCl 1N. A reação positiva apresenta um halo transparente em volta do inóculo, enquanto o restante do meio fica leitoso.

32 ONPG TSA com 1% de lactose - Prova da ß galactosidase – ONPG:
A presença ou ausência da atividade da enzima ß-galactosidase é demonstrada quando se emprega o composto orgânico – ONPG. Numa reação positiva, o reativo ONPG que é incolor, é hidrolizado liberando um composto cromogênico amarelo, o orto-nitrofenil.

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34 Identificação Coloração de flagelos é uma prova complementar utilizada, se necessário. Para a visualização da disposição e número de flagelos (polar único, polar >1, peritríqueo).

35 Identificação Principais semelhanças entre S. maltophilia e Complexo B. cepacia: Reação de oxidase lentamente positiva; Móveis; Lisina positiva; Hidrólise da esculina variável. Principais diferenças: - S. maltophilia Produzem DNase; Imipenem R; Oxidam a maltose rapidamente (antes da glicose). - Complexo B. cepacia Não produzem DNase; Polimixina R; Oxidam a maioria dos açúcares. Observações: - P. aeruginosa não produtora de piocianina (P) pode ser confundida com P. fluorescens ou P. putida. - P. aeruginosa não produtora de pigmentos pode ser confundida com A. xylosoxidans subsp xylosoxidans. Por isso, em alguns casos é necessário utilizar a coloração de flagelos para a diferenciação dos mesmos. - Todos os microrganismos descritos no Quadro 6 são sensíveis à polimixina, exceto a B. pseudomallei

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41 Resistência Em geral, os BGN-NF apresentam uma alta resistência aos antimicrobianos. Os principais problemas em BGN-NF são a resistência aos carbapenêmicos, que pode ser devida a diversos mecanismos de resistência, tais como: Produção de ß-lactamases (metalo-ß-lactamases); Perda de porina; Bomba de efluxo

42 Resistência P. aeruginosa produtora de metalo-ß-lactamases tem sido detectada em diversas partes do mundo. Complexo B. cepacia é intrinsecamente resistente a agentes antimicrobianos, incluindo ß-lactâmicos, exceto carbapenêmicos S. maltophilia é intrinsecamente resistente aos ß-lactâmicos, inclusive carbapenêmicos, devido à produção de ß-lactamases e baixa permeabilidade da membrana celular. Um dos grandes problemas no ambiente hospitalar é a multi-resistência apresentada por algumas cepas de Acinetobacter baumannii, alguns sensíveis apenas à polimixina. Chryseobacterium também apresentam resistência à polimixina B. . A alta resistência a múltiplos antimicrobianos é devida à combinação de vários mecanismos, incluindo permeabilidade seletiva da célula, alteração do alvo celular, inativação enzimática dos antibióticos e bomba de efluxo. Também são intrinsecamente resistentes à polimixina B.