Cardosina A Estrutura terciária.

Apresentação em tema: "Cardosina A Estrutura terciária."— Transcrição da apresentação:

1 Cardosina A Estrutura terciária

2 Precursor Intermediário Cardosina A madura
Intermediário Cardosina A madura Modelo proposto para o processamento proteolítico da Cardosina A. Os locais de clivagem Pro/cadeia de 31 KDa, cadeia de 31 KDa/PSI e PSI/cadeia de 15 KDa estão assinalados com setas. Pro 31 KDa 15 KDa PSI RGTVRDSGSA HAIGANGVMNQQ EHLSTSSEE

3 Cardosina A Estrutura secundária Cadeia de 31 KDa Cadeia de 15 KDa

4 Tampão citrato de sódio 100 mM, pH 3,5
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 1 Passo. Extracção Acídica Tampão citrato de sódio 100 mM, pH 3,5 1a. Centrifugação 1b. Filtração

5 propriedades dos compostos Propriedades Especiais
Biologia Celular Cromatografia Separação baseada em propriedades dos compostos Exclusão Molecular Solvente Massa Molecular Detector UV Direcção do fluxo Propriedades Especiais Proteínas fraccionadas MBarros

6 2 Passo. Cromatografia de Exclusão Molecular
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 2 Passo. Cromatografia de Exclusão Molecular Coluna: Superdex G75 Eluente: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 A0+A+B

7 Biologia Celular Cromatografia Carga Propriedades Especiais
Cromatografia de Troca Iónica Separação baseada em propriedades dos compostos Bombas A e B Carga Aplicação da amostra Detector UV Propriedades Especiais Mistura de proteínas Mistura de proteínas Gradiente linear de sal Força iónica Coluna de DEAE Tampão A Tampão B Proteínas carregadas + são eluídas primeiro + Resina Proteína + Proteína - + - MBarros + -

8 3 Passo. Cromatografia de troca iónica
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 3 Passo. Cromatografia de troca iónica Coluna: Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE) Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Gradiente crescente de 1M NaCl A B A0 +A

9 5. Controlo de Pureza das Cardosinas
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 5. Controlo de Pureza das Cardosinas Para o controlo de pureza das amostras de cardosinas recorre-se a electroforese vertical em gel de poliacrilamida, em condições desnaturantes (SDS-PAGE). A0 A B +A 31 KDa 15 KDa 34 KDa 14 KDa Após Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)

10 Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L.
4 Passo. Desalting – eliminar o sal das amostras da cromatografia anterior Coluna: Sephadex G25 Eluente: Água Mili_Q (água ultra pura) As amostras de cardosinas A0, A e B recolhidas na cromatografia de troca iónica são sujeitas a uma nova cromatografia de exclusão molecular numa coluna Desalting G25, com o objectivo de remover o sal. B +A

11 6 Passo. Recromatografia de troca iónica da amostra de cardosina B
Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 6 Passo. Recromatografia de troca iónica da amostra de cardosina B Coluna: Mono Q (trocador aniónico) Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Gradiente crescente de 1 M NaCl A amostra de cardosina B necessita de ser submetida a uma nova cromatografia de troca iónica numa coluna de maior resolução, a fim de remover a maior parte da cardosina A que contamina a amostra obtida na primeira troca iónica. B A

12 Biologia Celular Resumo
A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou afinidade por determinados ligandos Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma superfície sólida. A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém um gel constituído por esferas. A natureza das esferas determina o tipo de separação realizado. De acordo com: - a massa, cromatografia de exclusão molecular - a carga, cromatografia de troca iónica - a afinidade, cromatografia de afinidade MBarros