Começando a decifrar....

Apresentação em tema: "Começando a decifrar...."— Transcrição da apresentação:

1 Começando a decifrar...

2 O fenômeno de restrição-modificação
Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação. Arber, 1962 Nathans & Smith, 1962

3 Enzimas de restrição

4 Clivagem de restrição

5 Sítio de Restrição

6 Nomenclatura das enzimas de restrição
EcoRI Escherichia coli BamHI Bacillus amyloliquefaciens RH BglII Bacillus globigii PvuII Proteus vulgaris HindIII Haemophilus influenzae Rd HinfI Haemophilus influenzae Rf Sau3A Staphylococcus aureus AluI Arthrobacter luteus TaqI Thermus aquaticus HaeIII Haemophilus aegyptius NotI Nocardia otitidis-caviarum

7 Fracionamento de DNA

8 Mapa de Restrição

9 Utilização do Mapa

10 Detectar mutações

11 Comparação de Mapas

12 Fracionamento de DNA

13 Como reconhecer o fragmento de interesse?

14 Complementariedade

15 Hibridação Calor ou pH = desnaturação

16 Reassociação Temperatura e força iônica

17 Sonda

18 Marcação da sonda

19 Estringência Reação de Hibridação e Lavagem: especificidade da sonda
tamanho da sonda temperatura (T’m) força iônica Especificidade : identidade de seqüência Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo Temperatura: T’m - 25oC Força iônica: NaCl

20 Southern blot

21 Resultado

22 Hibridação in situ Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro Em azul claro os núcleos corados com DAPI

23 Southern blot Animação

24 O que fazer com o fragmento?
Clonagem de DNA A clonagem permite a eternizar o fragmento Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser produzido por um procarioto.

25 Vetores de clonagem O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem? 1. Replicação autônoma 2. Marcas de seleção 3. Sítio para clonagem

26 Sítio de clonagem O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas. Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.

27 Plasmídio recombinante

28 Transformação Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção,
contenção, multiplicação

29 Hospedeira transformada

30 Clonagem molecular

31 Outro vetor? Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb. YACs - fragmentos maiores ainda.

32 Biblioteca Genômica Genoteca

33 Varredura de biblioteca

34 Seqüenciamento de DNA Princípios

35 Reação em cadeia de polimerização
1. Replicação

36 PCR 2. Amplificação

37 PCR - ANIMAÇÃO Um momento, por favor, estou carregando o programa.