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Reagentes não Marcados
Testes utilizados em Imunologia Clínica – Reagentes não Marcados Profa Alessandra Xavier Pardini Disciplina Imunologia Clínica
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Resposta Imunológica Específica
- é mais elaborada reconhecimento - clonagem (multiplicação de células defesa) - ativação celular - processo complexo - células: ly T e B atacam especificamente o antígeno- resposta imunológica de memória
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Anticorpos Fab Fc símbolo Sítio de ligação do Ag Molécula de Ac
antígeno Determinante antigênico (epítopo) Cadeia leve Cadeia pesada Fab Fc Região de dobradiça
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Dinâmica de produção de Anticorpos durante a infecção Durante a infecção realiza-se pesquisa de IgM e IgG para diferenciar a fase em que se encontra a doença Tempo (dias) Primeira exposição ao Ag Segunda exposição ao Ag Resposta secundária Resposta primária Título de Ac no soro ( unidades)
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Determinação de limiar de reatividade
A – Limiar de máxima sensibilidade - triagem B – Limiar com máximas sensibilidade e especificidade – estudos epidemiológicos C – Limiar de máxima especificidade – diagnóstico
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Introdução - Os testes sorológicos ou imunoensaios são técnicas para a detecção de antígenos, anticorpos ou substâncias que desempenhem papel de antígenos - drogas, hormônios, ácidos nucléicos - Utilizam reagentes não marcados (precipitação aglutinação, floculação e complemento) ou reagentes marcados (fluorescência, radioimunoensaio, imunoenzimáticos) - Cada técnica apresenta vantagens, desvantagens, aplicação específica - Podem ser manuais ou semi ou totalmente automatizadas
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- Anticorpos monoclonais e Antígenos recombinantes = maior desenvolvimento (a) Ac monoclonais: produção, homogêneos, caracterizáveis (b) Ag recombinantes: caracterizáveis, produção em larga escala, especificidade Métodos: - aperfeiçoamento, consolidação do que já existe, tecnologias emergentes, melhora da sensibilidade, confiabilidade no resultado, execução mais simples e adaptáveis a automação - métodos multiparamétricos: desafio de detecção de substâncias diferentes simunltâneamente
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- Os testes sorológicos têm se tornado cada vez mais refinados e de execução simples, porém, para se garantir a qualidade dos resultados é necessário controle rigoroso - Técnicas cuidadosamente padronizadas (estudo de população, limiar de reatividade) = temperatura, pH, tempo de incubação, títulos, conjugados - As metas para o laboratório clínico devem melhorar a disponibilidade, exatidão e precisão dos testes clínicos, garantir a interpretação correta dos resultados
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Imunodiagnóstico Designa o diagnóstico por técnicas imunológicas que revelam a presença de determinado antígeno (Ag) ou anticorpo (Ac) no organismo Ensaios ou Testes de Precipitação Fixação do Complemento Neutralização ou Imunoensaios Imunofluorescência Radioimunoensaio Imunoenzimáticos Imunofluorimétricos Quimiluminescência
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Métodos de Imunoensaios
Reagentes não-marcados Precipitação Aglutinação Ensaios Líticos Reagentes marcados Radioativos Enzimáticos Fluorescentes Quimioluminescentes
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TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS: REAGENTES NÃO MARCADOS
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Técnicas rápidas Sistema homogêneo Sensibilidade reduzida Boa especificidade Direta – detecção de Ag Indireta – detecção de Ac Baixo custo Dificultam automação Problemas com reprodutibilidade Não permite detectar Ac de uma classe específica que sejam específicos para um determinado Ag – de uma só vez
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Precipitação - quantificação de complexo Ag-Ac - depende de [ ] relativas de Ag e Ac - excesso - dissolução do precipitado - zona de equilíbrio - precipitação máxima
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Concentração de Ag Excesso de Ag Excesso de Ac Equivalência Imunoprecipitação
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Imunodifusão - difusão de Ag e Ac solúveis em meio fluido ou semi sólido - complexo Ag-Ac - simples: fixa-se um dos reagentes no suporte e difunde-se o outro - complexo - dupla: ambos movem-se = encontro – complexo pode ser linear ou radial
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Imunodifusão Radial Simples (Mancini)
- utiliza placa de vidro - mistura de ágar com solução de anticorpos específicos - perfurações em locais apropriados do gel - as amostras + 3 concentrações conhecidas do Ag - quantificação de [ ] em soro ou líquor - sensibilidade de 1 a 3ug/mL de antígeno uso: Ig séricas, proteína C reativa (PRC) e proteínas do sistema complemento (C3, C4)
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diâmetro do halo de precipitação formado relaciona-se com a concentração do antígeno
construção de curva padrão permite determinar a conentração do antígeno
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Imunodifusão dupla (Ouchterlony)
- precipitação Ag-Ac - linhas ou arcos - ausência de linhas indica ausência de Ag ou Ac - depende de [ ] e tamanho da molécula, tamanho dos poros do gel, temperatura, [ ] e pureza do ágar - camada de ágar sobre lâmina de vidro - perfuração – aplicação da amostra - desvantagens: lenta e baixa sensibilidade Uso: vários sistemas antigênicos (artrite reumatóide, lupus, esclerose sistêmica, caxumba)
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Nefelometria - muito usada em laboratórios de análises clínicas - Ag+Ac em suspensão – dispersão de luz - Vantagens: automatizada, fácil, rápida, precisa, com sensibilidade adequada e pequenos volumes de amostra, não necessita separação de fases - Desvantagens: alto custo do anti-soro, reações inespecíficas, múltiplas diluições de antígenos muito concentrados - Sensibilidade - 1ug/mL Uso: Ig, componentes do complemento, fator reumatóide, proteína c-reativa, fatores de coagulação, imunocomplexos e hormônios
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Suspensão de Ac e Ag diluídos
Princípio partículas em suspensão – desvio de luz incidida dispersão de luz incidente quantificada por um detector Fonte de luz Suspensão de Ac e Ag diluídos Raios de luz focados Raios de luz desviados e refletidos Detector
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Nefelômetro acoplado a computador
Fonte de luz – lâmpadas de tungstênio, mercúrio, xenônio, hélio- neônio ou laser concentração - curva padrão Nefelômetro acoplado a computador
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Ag+Ac em suspensão – luz transmitida Detector - espectrofotômetro
Turbidimetria Ag+Ac em suspensão – luz transmitida Detector - espectrofotômetro Vantagens: não necessita separação de fases, rápida, precisa, econômica e automatizada Desvantagens: não pode ser usada em amostras muit turvas Uso: Ag, Ac, lipoproteínas, proteína C-reativa, albumina Fonte de luz branca Espectrofotômetro de fibra óptica Absorção e espectro de luz desviada e refletida
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Técnicas de Aglutinação
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Aglutinação - complexo Ag-Ac - agregados visíveis - semi-quantitativa – 500x mais sensível que precipitação - sensibilização de suporte – látex, hemácias - vantagens: < custo, facilidade e rapidez - desvantagens: reprodutibilidade, estabilidade do complexo formado e acessibilidade - vários tipos de sistemas
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Fatores interferentes
- classe de Ac - IgM 750 vezes mais eficiente que IgG - eletrólitos - pH ( ideal entre 6,0 e 8,0) - tempo - temperatura - estabilidade da ligação ao suporte (adsorção) - concentração de Ag ou Ac (falso -)
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REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Ag ou Ac adsorvido a partícula/célula Facilita a visualização do imunocomplexo Ag-Ac Tipos de reações Aglutinação Direta Inibição da aglutinação direta / hemaglutinação Aglutinação Indireta ou Passiva Hemaglutinação passiva Inibição da aglutinação passiva / hemaglutinação Reação de microflocução
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Aglutinação direta - partículas antigênicas insolúveis íntegras ou fragmentadas - Ag presente na partícula / célula – hemácias, bactérias, protozoários e fungos - realizado em tubo ou lâmina - Uso: identificação de grupo sanguíneo, diagnóstico de mononucleose infecciosa, toxoplasmose, brucelose, salmonelose, leptospirose - para a identificação de ANTÍGENOS (teste DIRETO)
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AGLUTINAÇÃO DIRETA Ac do soro Ag íntegro ou fragmentado aglutinação
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Resultado positivo Ag eritrocitário Ac Anti- eritrócito
Reagente de Coombs
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Tipagem de Sangue – direto (pesquisa de antígeno)
B AB O
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Aglutinação indireta ou passiva
- Ag solúveis adsorvidos na superfície da partículas inertes - hemácias – hemaglutinação - um dos melhores suportes - outros suportes: látex, carvão, gelatina e sepharose - detecta IgG e IgM / tratamento com 2-ME - lâmina ou microplaca em “V” ou “U” Uso: diagnóstico da toxoplasmose, doença de Chagas, fator reumatóide (FR), proteína C reativa (PRC), ASLO
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Esquema de realização de testes de aglutinação em placa –
teste de Látex (testes rápidos)
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Aglutinação indireta (passiva)
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AGLUTINAÇÃO INDIRETA OU PASSIVA
Ac do soro Ag solúvel adsorvido ao suporte aglutinação
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Aglutinação Indireta
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HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
Ac do soro Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia) aglutinação
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Hemaglutinação passiva
Ac do soro Ag solúvel adsorvido ao suporte (hemácia) Aglutinação
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Reação de microfloculação
- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) - RPR (Rapid Plasm Reagin) - suporte: cristais de colesterol - Ag: cardiolipina - placas escavadas - Uso: pesquisa de reaginas
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REAÇÃO DE MICROFLOCULAÇÃO
Ac da Amostra Suspensão antigênica: cardiolipina, colesterol e lecitina aglutinação Reação Positiva=
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Resultado VDRL Reação negativa Reação positiva Microscópio óptico 100x
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Reação de fixação de complemento (RFC)
– Boret e Gengou - qualitativo: sistema homogêneo de duas etapas – Mayer e cols. – quantitativo – Wassermanmn e Levine – micrométodo quantitativo - 1a etapa: interação Ag-Ac na presença de complemento - 2a etapa: adição do sistema indicador (Hc+hemolisina) difícil execução: reagentes padronizados - uso: doença de Chagas, sífilis, neurocisticercose
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Complemento liga-se ao complexo Ag- Ac Complemento não ligado
Soro com Ac Soro sem Ac Ag liga-se ao Ac Ag não ligado Complemento liga-se ao complexo Ag- Ac Complemento não ligado Indicador - Hemácias sensibilizadas com hemolisinas Indicador - Hemácias sensibilizadas com hemolisinas Hemácias íntegras no pellet Não houve lise Hemácias lisadas pelo complement o não ligado Hemólise Reativo Não reativo
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+ + REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO Ag sem hemólise Ac do soro
sistema indicador + complemento
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Agradecimentos Profa Adriana de Brito Profa Paula Knox Pelo material gentilmente cedido Referências Bibiolgráficas FERREIRA, AW & ÁVILA, SL Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes, 2001.
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Obrigada, Profa Alessandra
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