Microbiologia Clínica

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1 Microbiologia Clínica
Cocos Gram positivos Microbiologia Clínica

2 Staphylococcus spp.

3 Introdução O gênero Staphylococcus é composto de 37 espécies, 17 delas podem ser isoladas de amostras biológicas humanas. Os estafilococos são geralmente encontrados na pele e mucosas do homem e de outros animais. Muitas espécies são isoladas de partes específicas do corpo humano ou de certos animais, por exemplo: S. auricularis encontrado como parte da microbiota humana do conduto auditivo e S. hyicus causando dermatite infecciosa em suínos.

4 Micromorfologia Macromorfologia
Os estafilococos são cocos Gram-positivos, podem se apresentar isolados ou aos pares, em cadeias curtas ou agrupados. O aspecto macroscópico da colônia em meio sólido, presença de pigmento e hemólise em ágar sangue de carneiro são características auxiliares na identificação destes microrganismos. São imóveis, anaeróbios facultativos, não formadores de esporos e produtores de catalase.

5 Introdução Teste da catalase  diferencia os estafilococos (positiva) dos estreptococos (negativa). Prova da coagulase  identificar estafilococos patogênicos associados com infecções agudas, em geral, S. aureus em humanos. Provas específicas  pigmentação da colônia, prova da desoxiribonuclease, resistência à novobiocina, fermentação do manitol, entre outras. Rotineiramente, o teste da catalase é utilizado para diferenciar os estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase negativa). Entretanto, existem relatos na literatura de Staphylococcus aureus catalase negativa relacionados a processos infecciosos, embora raros, descritos em vários países, inclusive no Brasil. A catalase constitui um mecanismo de defesa para a bactéria contra células fagocitárias, porém não é um fator essencial para a sobrevivência do S. aureus. A identificação da espécie de estafilococos é baseada em uma variedade de características fenotípicas convencionais. As espécies mais importantes do ponto de vista clínico podem ser identificadas com algumas provas específicas, como pigmentação da colônia, estafilo-coagulase, “fator clumping” ou “fator de agregação”, prova da desoxiribonuclease, resistência à novobiocina, fermentação do manitol, entre outras. A habilidade de coagular o plasma continua sendo o critério mais aceito e utilizado para identificar estafilococos patogênicos associados com infecções agudas, em geral, S. aureus em humanos e animais e S. intermedius e S. hyicus em animais.

6 Importância clínica Os estafilococos estão entre os agentes mais freqüentemente relacionados a enfermidades humanas. Os processos infecciosos mais comuns incluem: - Pneumonias; - Bacteremias; - Infecções de pele e tecidos moles; - Infecções relacionadas ao uso de próteses e cateteres venosos; - Meningites. Também podem se apresentar como agentes colonizantes em seres humanos assintomáticos, principalmente da nasofaringe, pele e períneo, sendo este evento mais freqüente que a infecção. A colonização pode ocorrer logo após o nascimento e recorrer durante a vida, aumentando assim a chance de uma possível infecção. A colonização pode ser transitória ou persistente e pode se prolongar por longos períodos. Em algumas populações específicas, como usuários de drogas endovenosas, pacientes portadores de diabetes mellitus, pacientes em uso de cateteres venosos de longa permanência e trabalhadores da área da saúde, este microrganismo é mais freqüentemente encontrado como colonizante. Estes patógenos apresentam grande facilidade em se disseminar nos ambientes intra e inter-hospitalares, pela facilidade de sobreviver no meio ambiente.

7 Importância Clínica S. aureus  maior poder patogênico
Estafilococos coagulase negativa  era considerado como contaminante , mas nos últimos quinze a vinte anos houve um aumento na incidência de infecções de corrente sanguínea . Staphylococcus epidermidis  associadas ao uso de materiais protéticos e cateteres e são mais prevalentes em pacientes imunodeprimidos. Staphylococcus haemolyticus  endocardites, sepse, peritonite, entre outros quadros infecciosos. S. saprophyticus  segunda causa mais freqüente de cistites em mulheres jovens. O agente com maior poder patogênico é o S. aureus, reconhecido como um grande problema mundial, responsável por infecções relacionadas à assistência à saúde e comunitárias e resistentes a maioria dos antimicrobianos utilizados. O grupo conhecido como estafilococos coagulase negativa freqüentemente era considerado como contaminante no material clínico; entretanto, nos últimos quinze a vinte anos houve um aumento na incidência de infecções de corrente sanguínea por estes agentes e correlacionadas com aumento da mortalidade e morbidade. A espécie coagulase negativa mais freqüentemente isolada é o Staphylococcus epidermidis, geralmente associadas ao uso de materiais protéticos e cateteres e são mais prevalentes em pacientes imunodeprimidos. A segunda espécie mais prevalente é o Staphylococcus haemolyticus relacionada a endocardites, sepse, peritonite, entre outros quadros infecciosos. A espécie S. saprophyticus merece menção especial por ser um patógeno bem documentado e a segunda causa mais freqüente de cistites em mulheres jovens.

8 Importância Clínica MRSA HA-MRSA CA-MRSA (PVL)
Recentemente, vários relatos de infecções de pele e tecidos moles relacionadas a cepas de S. aureus resistentes à meticilina adquiridos na comunidade, denominados (CA-MRSA), demonstraram características diferentes dos isolados de S. aureus resistentes à meticilina adquiridos no hospital (HA-MRSA Outro ponto é a presença da toxina Panton Valentine Leucocidine (PVL) nos CA-MRSA, que é capaz de induzir a destruição de leucócitos humanos e causar grande dano tecidual, sendo considerado um fator de virulência relacionada com infecções de pele, tecidos moles e pneumonia necrotizante grave.

9 Isolamento As espécies de Micrococcus e de Staphylococcus produzem colônias características em ágar sangue de carneiro. Os micrococos em geral crescem mais lentamente, e com freqüência são necessárias 48 h de incubação antes que a morfologia típica das colônias possa ser diferenciada. Após este período, as colônias de micrococos têm de 1,0 a 2,0 mm de diâmetro, são opacas, marcadamente convexas com borda contínua e algumas cepas produzem pigmento amarelado, rosado, alaranjado ou bronzeado, outras esbranquiçadas ou branco-osso. As colônias de estafilococos são geralmente de crescimento mais rápido, com 1,0 a 2,0 mm de diâmetro após 24 h de incubação, são usualmente lisas, butirosas e convexas, com borda contínua e coloração branco-porcelana ou cinzas. As colônias de S. aureus podem ter pigmento amarelo ou amarelo-alaranjado, podendo apresentar hemólise. A coloração amarelada no S. aureus aparece mais pronunciada após incubação de 72 h em temperatura ambiente. O teste mais importante na identificação dos estafilococos é a prova da coagulase, que divide os estafilococos em duas categorias: - Staphylococcus coagulase negativa (SCN); - Staphylococcus aureus. S. aureus; S. epidermidis; S. saprophyticcus; Micrococcus spp. em Ágar sangue

10 Isolamento S. aureus; TSA; MAS, CLED, ACHOC
As espécies de Micrococcus e de Staphylococcus produzem colônias características em ágar sangue de carneiro. Os micrococos em geral crescem mais lentamente, e com freqüência são necessárias 48 h de incubação antes que a morfologia típica das colônias possa ser diferenciada. Após este período, as colônias de micrococos têm de 1,0 a 2,0 mm de diâmetro, são opacas, marcadamente convexas com borda contínua e algumas cepas produzem pigmento amarelado, rosado, alaranjado ou bronzeado, outras esbranquiçadas ou branco-osso. As colônias de estafilococos são geralmente de crescimento mais rápido, com 1,0 a 2,0 mm de diâmetro após 24 h de incubação, são usualmente lisas, butirosas e convexas, com borda contínua e coloração branco-porcelana ou cinzas. As colônias de S. aureus podem ter pigmento amarelo ou amarelo-alaranjado, podendo apresentar hemólise. A coloração amarelada no S. aureus aparece mais pronunciada após incubação de 72 h em temperatura ambiente. O teste mais importante na identificação dos estafilococos é a prova da coagulase, que divide os estafilococos em duas categorias: - Staphylococcus coagulase negativa (SCN); - Staphylococcus aureus. S. aureus; TSA; MAS, CLED, ACHOC

11 Identificação Prova da catalase
Finalidade: Verificar a presença da enzima catalase que decompõe H2O2 em água e O2 e, desta forma, distinguir os grupos estafilococos e estreptococos. Procedimento: Com alça bacteriológica, retirar uma colônia do meio de cultura (preferencialmente não retirar colônias crescidas em Agar sangue porque os fragmentos podem se misturar com as colônias e produzir um resultado falso-positivo). Colocar a colônia sobre uma lâmina de vidro e adicionar uma gota de H2O2 a 3%. Leitura: Observar a formação de bolhas. Interpretação: Formação de bolhas indica ser a família Microccocaceae (Ex.: Staphylococcus spp., Micrococcus spp., Planococcus spp., Stomatococcus spp.); Sem formação de bolhas indica ser a família Streptococcacea (Ex.: Enterococcus spp., Streptococcus spp., Aerococcus spp., Gemella spp., Leuconostoc spp., Lactococcus spp.)

12 Identificação Prova da coagulase A – Em tubo
Finalidade: Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada, que, reagindo com um fator plasmático, forma um complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando a fibrina. - Procedimento: Colocar 0,5 mL de plasma em tubo de ensaio; Adicionar uma alçada de colônia diretamente no plasma de coelho com EDTA; Incubar por 4 h a 35±2ºC em estufa ou banho-maria; caso não haja formação de coágulo, incubar por 24 h. - Leitura: Formação de coágulo observada pela inclinação suave. Interpretação: Formação de coágulo inteira ou parcial, identifica Staphylococcus aureus; Não há formação de coágulo, identifica Staphylococcus coagulase negativa. B - Em lâmina - Finalidade: Verificar se o microrganismo possui a coagulase (ou fator aglutinante) ligada na superfície da parede celular, que reagindo com o fibrinogênio do plasma, causa a coagulação do mesmo. - Procedimento: Colocar 2 gotas de salina em uma lâmina; Emulsionar uma colônia isolada a ser testada; Colocar uma gota de plasma e misturar. Não se recomenda realizar o teste a partir de um ágar com grande concentração de sal como, por exemplo, o ágar manitol. - Leitura: Formação de grumos em 10 segundos. Formação de coágulo ou grumos, identifica Staphylococcus aureus; Não há formação de coágulo ou grumos, identifica Staphylococcus coagulase negativa.

13 Identificação Teste da DNase com HCl 1N
- Finalidade: Verificar se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada o ácido nucléico (DNA). - Procedimento: Fazer um inóculo denso de forma circular em uma pequena parte do meio; Incubar a 35±2ºC por h. (A placa pode ser inoculada com várias cepas); Decorrido o período de incubação, no momento da leitura colocar o HCl 1N de maneira que cubra as colônias, aguardar 30 segundos. - Leitura: Formação de um halo transparente ao redor do crescimento bacteriano. Interpretação: Formação de halo transparente, identifica Staphylococcus aureus; Ausência de formação de halo transparente, identifica Staphylococcus coagulase negativa, conforme observado

14 Identificação Teste de fermentação do manitol
- Finalidade: Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol contendo 7,5% de cloreto de sódio. - Procedimento: Fazer pequenos círculos no ágar com a colônia suspeita; Incubar a 35±2ºC por h. - Formação de halo amarelo ao redor das colônias. Interpretação: Formação de halo amarelo ao redor das colônias, identifica Staphylococcus aureus; Meio permanece inalterado ao redor das colônias, identifica Staphylococcus coagulase negativa. Obs.: Outras espécies de estafilococos, com pouca freqüência, também podem produzir ácido a partir do manitol, portanto também devem ser testados quanto à produção de coagulase.

15 Identificação Teste de resistência à novobiocina
- Finalidade: Verificar se o microrganismo é resistente à novobiocina. - Procedimento: Semear como antibiograma em ágar Müeller-Hinton; Colocar um disco de novobiocina 5 µg/mL; Incubar a 35±2ºC por h. - Leitura: Formação de halo, que deve ser medido. - Interpretação: Formação de halo ≤ 16 mm, identifica Staphylococcus saprophyticus. Obs.: Outros poderão apresentar esta resistência, mas são incomuns e sem importância clínica

16 Identificação Teste de resistência à bacitracina
- Finalidade: Diferenciar Staphylococcus spp. de Micrococcus spp. - Procedimento: Semear como antibiograma em ágar Müeller-Hinton ou ágar sangue de carneiro; Colocar um disco de bacitracina 0,04 U; Incubar a 35 a 37ºC por h. - Leitura: Formação de halo, que deve ser medido. Interpretação: Formação de halo ≥ 10 mm, identifica Micrococcus spp.; Formação de halo ≤ 9 mm, identifica Staphylococcus spp.

17 Identificação Os estafilococos são os microrganismos isolados com maior freqüência nos laboratórios clínicos, principalmente os coagulase-negativa O método convencional é trabalhoso, requer muito tempo para realização e não é adequado para ser implantado como procedimento de rotina nos laboratórios clínicos. A identificação completa até espécies, utilizando-se um sistema comercial ou procedimento manual de referência, deve ser reservada para isolados clinicamente significativos Os estafilococos são os microrganismos isolados com maior freqüência nos laboratórios clínicos, principalmente os coagulase-negativa; portanto, decisões quanto ao custo-benefício de até onde chegar com a identificação são muito importantes. O método convencional é trabalhoso, requer muito tempo para realização e não é adequado para ser implantado como procedimento de rotina nos laboratórios clínicos. A identificação completa até espécies, utilizando-se um sistema comercial ou procedimento manual de referência, deve ser reservada para isolados clinicamente significativos, hemoculturas, cateter endovenoso, amostras de sítios estéreis ou quando o mesmo estafilococo coagulase-negativa for isolado repetidas vezes. A decisão de realizar a identificação mais detalhada deve ser tomada considerando cada caso e com a participação do laboratório e dos médicos assistentes.

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20 Enterococcus spp.

21 Introdução Enterococcus, Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Abiotrophia, Globicatella e Leuconostoc,  cocos Gram-positivos agrupados em cadeia, anaeróbios facultativos e catalase negativa. desde 1984 Enterococcus passou a constituir um gênero Sobrevivem na concentração de 6,5% de NaCl e fazem hidrólise da esculina na presença de 40% de sais de bile. Diferenciam-se dos demais gêneros pela hidrólise da pirrolidonil-ß-naftilamida (PYR) Enterococcus, desde 1984 passou a constituir um gênero e, juntamente com os Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus, Abiotrophia, Globicatella e Leuconostoc, faz parte do grupo dos cocos Gram-positivos agrupados em cadeia, anaeróbios facultativos e catalase negativa. Estes microrganismos caracterizam-se também pela capacidade de crescimento a 10°C e 45°C e em pH 9,6. Sobrevivem na concentração de 6,5% de NaCl, a 60°C por 30 minutos e também fazem hidrólise da esculina na presença de 40% de sais de bile. Além destas características, diferenciam-se dos demais gêneros pela hidrólise da pirrolidonil-ß-naftilamida (PYR), que ocorre na maior parte das espécies e também da leucina-ß-naftilamida (LAP).

22 Importância clínica Distribuídos na natureza e microbiota normal do ser humano. E. faecalis e E. faecium são os mais associados a manifestações clínicas. Outras espécies como E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans e E. avium são clinicamente de menor importância. Causam infecções relacionadas à assistência à saúde, como: - Endocardite bacteriana; - Infecções do trato urinário (ITU); - Infecções da corrente sanguínea (ICS); - Infecções de sítio cirúrgico e intra-abdominais. - No trato urinário, além de infecção, podem representar colonização ou bacteriúria assintomática. Os enterococos, além de serem amplamente distribuídos na natureza, fazem parte da microbiota normal do ser humano, principalmente do trato gastrointestinal. Podem ser isolados em indivíduos saudáveis em outras localizações como pele, região peri-anal, via hépato-biliar e em secreções de orofaringe e vaginal. Dentre as espécies descritas, os E. faecalis e E. faecium são os mais associados a manifestações clínicas. Outras espécies como E. gallinarum, E. casseliflavus, E. durans e E. avium são clinicamente de menor importância. A associação deste gênero com endocardite bacteriana é classicamente conhecida. Por outro lado, denota-se atualmente o isolamento destas bactérias, em diversos sítios, causando infecções relacionadas à assistência à saúde, como: - Infecções do trato urinário (ITU); - Infecções da corrente sanguínea (ICS); - Infecções de sítio cirúrgico e intra-abdominais. - No trato urinário, além de infecção, podem representar colonização ou bacteriúria assintomática. Mais raramente, são descritas pneumonias em pacientes debilitados, bem como empiema em portadores de doença hepática, mesmo na ausência de outras manifestações respiratórias. As meningites também são apontadas como infecções infreqüentes, ocorrendo na presença de fatores predisponentes, como o período neonatal, alterações do sistema nervoso, incluindo defeitos anatômicos e procedimentos neurocirúrgicos, doenças crônicas de base e, em dados mais recentes, em pacientes portadores da síndrome da imunodeficiência humana (AIDS).

23 Isolamento Os métodos habitualmente padronizados para coleta de sangue, urina, amostras cirúrgicas e de outros sítios são adequados na suspeita da existência de enterococos. Pelo fato de serem relativamente resistentes às condições ambientais, não existem recomendações específicas para o transporte destas amostras. As diferentes espécies de enterococos multiplicam-se bem em ágar Müeller-Hinton acrescidos ou não de sangue, ou ainda com outras bases como Brain Heart Infusion (BHI) e outros meios enriquecidos. Os métodos habitualmente padronizados para coleta de sangue, urina, amostras cirúrgicas e de outros sítios são adequados na suspeita da existência de enterococos. Pelo fato de serem relativamente resistentes às condições ambientais, não existem recomendações específicas para o transporte destas amostras. As diferentes espécies de enterococos multiplicam-se bem em ágar Müeller-Hinton acrescidos ou não de sangue, ou ainda com outras bases como Brain Heart Infusion (BHI) e outros meios enriquecidos. O ágar azida é um exemplo de meio enriquecido bastante utilizado para o isolamento destas bactérias, principalmente quando existe a possibilidade da amostra conter concomitantemente bacilo Gram-negativo. Em ágar sangue, as colônias, após 24 h de crescimento, têm aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro. Aproximadamente um terço dos Enterococcus faecalis apresentam-se com beta-hemólise em ágar contendo sangue humano, coelho ou cavalo, mas são não-hemolíticas em sangue de carneiro. As outras espécies são usualmente não-hemolíticas.

24 Isolamento A temperatura adequada de crescimento é de 35±2ºC
Algumas cepas crescerem melhor em concentrações aumentadas de CO2 não existe necessidade de atmosfera especial. Quando se pretende identificar portadores de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE), as amostras indicadas são aquelas obtidas através de coleta de swab anal, swab ou fezes. Uso de meios seletivos para o isolamento de VRE em amostras do trato intestinal. O uso de meios cromogênicos é uma opção.

25 Identificação A presença de cocos Gram-positivos dispostos aos pares ou em cadeias, catalase negativa com prova de PYR positiva, crescimento em caldo de NaCl a 6,5% e hidrólise da esculina são provas presentes na maioria das espécies do gênero Enterococcus. A temperatura adequada de crescimento é de 35±2ºC e, apesar de algumas cepas crescerem melhor em concentrações aumentadas de CO2 não existe necessidade de atmosfera especial. O uso de meios cromogênicos é uma opção, uma vez que pode haver liberação do resultado com mais agilidade e ainda permite maior facilidade de isolamento em amostras não puras. Quando se pretende identificar portadores de Enterococcus spp. resistentes à vancomicina (VRE), as amostras indicadas são aquelas obtidas através de coleta de swab anal, swab peri-anal (método de triagem recomendado pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) ou fezes. A sensibilidade, do método, está relacionada com a densidade de microrganismos encontrados nas fezes. Considerando-se que a flora intestinal se caracteriza por um número expressivo de bactérias, é necessário o uso de meios seletivos para o isolamento de VRE em amostras do trato intestinal.

26 Identificação Ágar bile-esculina
Princípio: Esculina presente no meio é hidrolizada, formando esculetina e dextrose. A esculetina reage com sais de ferro presentes no meio tornando-o enegrecido. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. e Streptococcus bovis (Streptococcus do grupo D) de Streptococcus spp. Procedimento: Inoculam-se 2 a 3 colônias a serem testadas em base contendo bile-esculina; Incubam-se a 35±2ºC por até 72 h. - Interpretação: Presença de cor enegrecida no meio é indicativa da presença de hidrólise, isto é, uma prova positiva.

27 Identificação NaCl 6,5% - Princípio: Capacidade do microrganismo crescer em altas concentrações de sal. Tem por finalidade diferenciar Enterococcus spp. de Streptococcus spp. - Procedimento: Inoculam-se 2 a 3 colônias a serem testadas em um caldo BHI suplementado com 6,0% de NaCl (com ou sem indicador); Incubam-se a 35±2ºC por até 72 h. - Interpretação: A turvação ou mudança de cor (no caso de adição de indicador) é indicativa de crescimento bacteriano.

28 Identificação Existem diversos testes convencionais que levam à identificação das espécies de Enterococcus e gêneros relacionados, classificando-o em cinco diferentes grupos fisiológicos. Estes incluem a hidrólise da arginina, a detecção da produção de ácido a partir de diferentes carboidratos: arabinose, sorbitol, manitol, rafinose, sorbose e sacarose, utilização do piruvato de sódio, motilidade e produção de pigmento.

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31 Streptococcus spp

32 Introdução As bactérias do gênero Streptococcus são capazes de causar diversas doenças nos seres humanos. Dentre as mais freqüentes estão as infecções do trato respiratório, pele e tecidos moles, endocardites, sepse e meningites. Streptococcus pneumoniae, o pneumococo, é um dos agentes que mais freqüentemente causam doenças invasivas graves, como meningite e bacteremia. . As bactérias do gênero Streptococcus são capazes de causar diversas doenças nos seres humanos. Dentre as mais freqüentes estão as infecções do trato respiratório, pele e tecidos moles, endocardites, sepse e meningites. Streptococcus pneumoniae, o pneumococo, é um dos agentes que mais freqüentemente causam doenças invasivas graves, como meningite e bacteremia. Os estreptococos, da família Streptococcaceae são caracterizados como cocos Gram-positivos, anaeróbios facultativos, não produtores de catalase e de citocromo-oxidase. Os estreptococos com relevância clínica são homofermentadores, sendo o ácido lático o produto final da fermentação da glicose. Podem produzir hemolisinas, e os tipos de reação hemolítica em meio sólido contendo 5% de sangue de carneiro, descritos a seguir, têm sido utilizados na classificação de estreptococos.

33 Introdução Os estreptococos, da família Streptococcaceae são caracterizados como cocos Gram-positivos, anaeróbios facultativos, não produtores de catalase e de citocromo-oxidase. Os estreptococos com relevância clínica são homofermentadores, sendo o ácido lático o produto final da fermentação da glicose. Podem produzir hemolisinas, e os tipos de reação hemolítica em meio sólido contendo 5% de sangue de carneiro, descritos a seguir, têm sido utilizados na classificação de estreptococos. As bactérias do gênero Streptococcus são capazes de causar diversas doenças nos seres humanos. Dentre as mais freqüentes estão as infecções do trato respiratório, pele e tecidos moles, endocardites, sepse e meningites. Streptococcus pneumoniae, o pneumococo, é um dos agentes que mais freqüentemente causam doenças invasivas graves, como meningite e bacteremia. Os estreptococos, da família Streptococcaceae são caracterizados como cocos Gram-positivos, anaeróbios facultativos, não produtores de catalase e de citocromo-oxidase. Os estreptococos com relevância clínica são homofermentadores, sendo o ácido lático o produto final da fermentação da glicose. Podem produzir hemolisinas, e os tipos de reação hemolítica em meio sólido contendo 5% de sangue de carneiro, descritos a seguir, têm sido utilizados na classificação de estreptococos.

34 Introdução Alfa-hemólise ( α ): é caracterizada por uma hemólise parcial, associada com a perda parcial de hemoglobina pelas hemácias, ocorrendo uma zona cinza-esverdeada no meio de cultura ao redor da colônia. Streptococcus pneumoniae caracteriza-se por produzir este tipo de hemólise. Beta-hemólise ( ß ): é caracterizada pela lise completa das hemácias que rodeiam a colônia, ocorrendo uma zona transparente (zona de lise total) ao redor da colônia. Os estreptococos com esta característica são denominados beta-hemolíticos. Gama-hemólise (γ): é caracterizada pela ausência de hemólise. Cepas desses microrganismos não hemolíticos, ou γ-hemolíticos, não causam modificação no meio de ágar sangue de carneiro.

35 Introdução Pneumococos  autólise pode ser aumentada pela adição de sais biliares ao meio de cultura. Como são lisados facilmente por detergentes fracos, como a bile, desoxicolato de sódio e optoquina, esta característica é útil para distingui-los de outras bactérias. Quanto às características das células, os pneumococos são Gram-positivos, com morfologia de diplococos lanceolados, ou seja, com as extremidades em ponta de lança ou em chama de vela. Medem 0,5 a 1,25 µm de diâmetro e dispõem-se aos pares (diplococos), em razão de sua divisão em apenas um plano, ou em cadeias curtas. Pneumococos não possuem a enzima catalase a autólise pode ser aumentada pela adição de sais biliares ao meio de cultura. Como são lisados facilmente por detergentes fracos, como a bile, desoxicolato de sódio e optoquina, esta característica é útil para distingui-los de outras bactérias. As colônias de Streptococcus β-hemolíticos dos grupos A, C e G são relativamente grandes quando comparadas com as colônias pontuais de outras cepas β-hemolíticas (grupo S.milleri). Eventualmente colônias do S. pyogenes podem ser mucóides. Quanto às características das células, os pneumococos são Gram-positivos, com morfologia de diplococos lanceolados, ou seja, com as extremidades em ponta de lança ou em chama de vela. Medem 0,5 a 1,25 µm de diâmetro e dispõem-se aos pares (diplococos), em razão de sua divisão em apenas um plano, ou em cadeias curtas. São imóveis (sem flagelos), não formam esporos e podem possuir cápsula, o seu principal fator de patogenicidade. Podem perder a característica de Gram-positivos quando o cultivo ultrapassa a fase logarítmica, período mais ativo do crescimento bacteriano.

36 Introdução As colônias de Streptococcus β-hemolíticos dos grupos A, C e G são relativamente grandes quando comparadas com as colônias pontuais de outras cepas β-hemolíticas (grupo S.milleri). Eventualmente colônias do S. pyogenes podem ser mucóides. São imóveis (sem flagelos), não formam esporos e podem possuir cápsula, o seu principal fator de patogenicidade. Podem perder a característica de Gram-positivos quando o cultivo ultrapassa a fase logarítmica, período mais ativo do crescimento bacteriano Pneumococos não possuem a enzima catalase a autólise pode ser aumentada pela adição de sais biliares ao meio de cultura. Como são lisados facilmente por detergentes fracos, como a bile, desoxicolato de sódio e optoquina, esta característica é útil para distingui-los de outras bactérias. As colônias de Streptococcus β-hemolíticos dos grupos A, C e G são relativamente grandes quando comparadas com as colônias pontuais de outras cepas β-hemolíticas (grupo S.milleri). Eventualmente colônias do S. pyogenes podem ser mucóides. Quanto às características das células, os pneumococos são Gram-positivos, com morfologia de diplococos lanceolados, ou seja, com as extremidades em ponta de lança ou em chama de vela. Medem 0,5 a 1,25 µm de diâmetro e dispõem-se aos pares (diplococos), em razão de sua divisão em apenas um plano, ou em cadeias curtas. São imóveis (sem flagelos), não formam esporos e podem possuir cápsula, o seu principal fator de patogenicidade. Podem perder a característica de Gram-positivos quando o cultivo ultrapassa a fase logarítmica, período mais ativo do crescimento bacteriano. A cápsula de polissacarídeo que envolve externamente o pneumococo é seu constituinte mais importante, sob vários aspectos. O polissacarídeo capsular (PS) é um determinante essencial para a antigenicidade do pneumococo, e sua diversidade bioquímica induz respostas imunológicas específicas, nas quais se baseia a classificação dos pneumococos em tipos. A diversidade antigênica do PS de S. pneumoniae é responsável pela diferenciação desta única espécie em pelo menos 91 sorotipos. A cápsula é o principal fator de virulência destas bactérias, protegendo-as da fagocitose e do reconhecimento pelo sistema imunológico, assim permitindo a sua sobrevivência, multiplicação e disseminação para vários órgãos. A virulência e o poder de invasão do pneumococo variam entre os sorotipos e entre cepas de um mesmo sorotipo, dependendo da quantidade de PS produzido. Apesar do grande número de sorotipos, cerca de 23 deles são os responsáveis pela maioria das doenças pneumocócicas em todo o mundo.

37 Importância clínica Streptococcus pneumoniae:
A pneumonia é a mais freqüente das doenças pneumocócicas, sendo considerada uma das doenças mais incidentes e graves que acometem o homem. Atinge todas as faixas etárias, principalmente crianças e idosos. Derrame pleural é a complicação mais comum, e empiema é a de maior gravidade. O S. pneumoniae é o principal agente das pneumonias bacterianas em idosos e crianças até cinco anos e é responsável por 10% a 25% de todas as pneumonias em todas as faixas etárias, sendo estimadas mortes anuais em todo o mundo. - Bacteremia pneumocócica pode ocorrer em associação com uma simples faringite ou sepse fulminante, com púrpura e hemorragia da adrenal (síndrome de Waterhouse-Friderichsen). É a manifestação clínica mais freqüente em crianças, que pode evoluir para meningite, principalmente entre aquelas menores de dois anos de idade. Na maioria dos adultos com bacteremia pneumocócica há associação com pneumonia. Quantidade desta bactéria na nasofaringe é geralmente limitada pela competição com os outros componentes da microbiota local e pelos mecanismos inespecíficos de defesa do hospedeiro, como movimento muco-ciliar, tosse, coriza e reflexo epiglotal, os quais previnem a penetração do pneumococo através do epitélio do sistema respiratório superior. De modo geral, a aquisição do pneumococo na nasofaringe começa logo após o nascimento, atinge a taxa máxima nas crianças de pré-escola e diminui com o avançar da idade. Praticamente todas as pessoas já foram colonizadas por esta bactéria em algum estágio da vida. A taxa de isolamento de pneumococos da nasofaringe de indivíduos saudáveis, isto é a taxa de portadores, varia de 20% a 40% e o estado de portador é mais freqüente nos meses de inverno. S. pneumoniae é um organismo exigente sob o ponto de vista nutricional, além de sensível ao calor, frio e baixa umidade. Assim, sua transmissão requer contato pessoa a pessoa. A via de transmissão é aérea, por meio de gotículas de saliva de portadores ou pacientes, eliminadas principalmente durante a tosse ou espirro. A doença ocorre quando a resistência do hospedeiro está diminuída, após uma infecção viral prévia ou após a aquisição de uma cepa mais virulenta, seguida por alteração da microbiota. As doenças pneumocócicas são mais prevalentes no outono, inverno e primavera. Todas as faixas etárias, gêneros e etnias humanas são susceptíveis às doenças por pneumococo. Entretanto são altamente susceptíveis os indivíduos com imaturidade ou alguma forma de comprometimento do sistema imunológico, como os muito jovens e os idosos.

38 Importância clínica Streptococcus pneumoniae
A meningite pneumocócica é a complicação mais comum decorrente de sinusite, mastoidite, otite ou pneumonia. A meningite pneumocócica atinge percentuais bastante elevados de letalidade (acima de 30%) além de causar seqüelas graves. A otite média aguda está associada à grande morbidade em crianças menores de cinco anos, incluindo perda auditiva. Nos Estados Unidos da América, é a causa mais freqüente das consultas pediátricas. Menos freqüentemente o pneumococo causa artrite séptica e peritonite. Geralmente migra para a articulação durante a bacteremia de foco pulmonar, de meninges e de endocardite bacteriana, ou para a cavidade peritoneal em associação com hepatopatias. Quantidade desta bactéria na nasofaringe é geralmente limitada pela competição com os outros componentes da microbiota local e pelos mecanismos inespecíficos de defesa do hospedeiro, como movimento muco-ciliar, tosse, coriza e reflexo epiglotal, os quais previnem a penetração do pneumococo através do epitélio do sistema respiratório superior. De modo geral, a aquisição do pneumococo na nasofaringe começa logo após o nascimento, atinge a taxa máxima nas crianças de pré-escola e diminui com o avançar da idade. Praticamente todas as pessoas já foram colonizadas por esta bactéria em algum estágio da vida. A taxa de isolamento de pneumococos da nasofaringe de indivíduos saudáveis, isto é a taxa de portadores, varia de 20% a 40% e o estado de portador é mais freqüente nos meses de inverno. S. pneumoniae é um organismo exigente sob o ponto de vista nutricional, além de sensível ao calor, frio e baixa umidade. Assim, sua transmissão requer contato pessoa a pessoa. A via de transmissão é aérea, por meio de gotículas de saliva de portadores ou pacientes, eliminadas principalmente durante a tosse ou espirro. A doença ocorre quando a resistência do hospedeiro está diminuída, após uma infecção viral prévia ou após a aquisição de uma cepa mais virulenta, seguida por alteração da microbiota. As doenças pneumocócicas são mais prevalentes no outono, inverno e primavera. Todas as faixas etárias, gêneros e etnias humanas são susceptíveis às doenças por pneumococo. Entretanto são altamente susceptíveis os indivíduos com imaturidade ou alguma forma de comprometimento do sistema imunológico, como os muito jovens e os idosos.

39 Importância clínica A antibioticoterapia utilizada no tratamento da doença pneumocócica reduziu significativamente a taxa de mortalidade, porém a incidência desta doença permaneceu inalterada. Em muitos casos, mesmo com o uso de antibiótico, há falha de tratamento. Assim, as pesquisas em pneumococo foram retomadas na década de 1970 com o intuito de desenvolver novas vacinas pneumocócicas. As vacinas já existentes (23-valente não conjugada e 7-valente conjugada) têm como antígeno os sorotipos, 23 e 7 sorotipos, respectivamente, que mais freqüentemente causam doença. Como a distribuição destes sorotipos varia entre as regiões geográficas, faixas etárias e ao longo do tempo, é muito importante sob o ponto de vista epidemiológico que se conheçam os sorotipos prevalentes. Os estudos de avaliação da vacina conjugada indicam que protege contra doença pneumocócica invasiva causada pelos sorotipos componentes da vacina. Além da proteção, reduz a taxa de colonização ou de portadores, inclusive em outras faixas etárias, diminuindo assim a disseminação da bactéria e induzindo imunidade coletiva ou imunidade de “rebanho”.

40 Importância clínica S. pyogenes
Esta espécie pertence ao grupo A de Lancefield, são colônias β-hemolíticas, com vários fatores de virulência. Podem causar faringites, infecções respiratórias, impetigo, erisipela, endocardites, meningites e artrites. Infecções por cepas produtoras de toxinas podem causar a febre escarlatina e choque tóxico. A faringite por S. pyogenes é comum e pode evoluir com seqüelas como febre reumática e glomerulonefrite aguda.

41 Importância clínica S. agalactiae
Esta espécie é β-hemolítica, pertence ao grupo B de Lancefield. Podem causar infecções graves em neonatologia, como sepse e meningite. A detecção deste patógeno no trato genital e/ou gastrointestinal de parturientes pode identificar um risco para infecção dos recém-nascidos e guiar a terapia antimicrobiana intra-parto. Algumas condições (neoplasias, imunodeficiências e diabetes mellitus) podem predispor adultos a infecções por este patógeno como bacteremia, endocardite, infecções de pele e tecidos moles, pneumonia e osteomielites.

42 Importância clínica Streptococcus do grupo viridans
Este grupo de bactérias faz parte da microbiota normal da cavidade oral, trato gastrointestinal e trato genital, e freqüentemente são considerados contaminantes quando isolados de hemoculturas. Entretanto sua presença pode estar associada a endocardite subaguda, especialmente em portadores de próteses valvares, sendo S. sanguis, S. mitis, S. oralis e S. gordonii os agentes mais encontrados. S. mutans e S. sobrinus são espécies isoladas de placas dentárias e cáries.

43 Isolamento Meios de cultura Base para os meios de cultura:
-As bases recomendadas para o isolamento e subseqüente cultivo do pneumococo são meios complexos, como Müeller-Hinton (MH), Columbia, Trypticase Soy (TS), Brain Heart Infusion (BHI), Blood Agar Base (BAB). - Quando sólidos, contêm ágar. Devem ser acrescidos de 5% ou 10% de sangue desfibrinado estéril de carneiro, coelho ou cavalo. Ágar chocolate: Este meio é rico e suporta as exigências nutritivas para o isolamento de S. pneumoniae, quando incubado em atmosfera de 5 - 7% CO2. Acrescenta-se à base aquecida a °C, 10% de sangue, freqüentemente de cavalo. Distribuir em tubos ou frascos inclinado ou em placas de Petri. Semear na sua superfície. Em doenças invasivas, o S. pneumoniae pode ser isolado de diferentes líquidos normalmente estéreis, como líquido cefalorraquidiano (LCR), sangue, líquidos pleural, ascítico e sinovial, e em secreções de abscessos, entre outros. Os meios de cultura apropriados são essenciais para o sucesso do isolamento e caracterização dos pneumococos e estão citados a seguir. Meios de cultura Base para os meios de cultura:  As bases recomendadas para o isolamento e subseqüente cultivo do pneumococo são meios complexos, como Müeller-Hinton (MH), Columbia, Trypticase Soy (TS), Brain Heart Infusion (BHI), Blood Agar Base (BAB). Quando sólidos, contêm ágar. Devem ser acrescidos de 5% ou 10% de sangue desfibrinado estéril de carneiro, coelho ou cavalo. Ágar chocolate: Este meio é rico e suporta as exigências nutritivas para o isolamento de S. pneumoniae, quando incubado em atmosfera de 5 - 7% CO2. Acrescenta-se à base aquecida a °C, 10% de sangue, freqüentemente de cavalo. Distribuir em tubos ou frascos inclinado ou em placas de Petri. Semear na sua superfície. Também é usado para conservação das bactérias por tempo curto, em torno de uma semana. Pode ser utilizado para o transporte, para o envio a outro laboratório, de preferência inclinado em frasco tipo penicilina bem vedado. Meio para hemocultura: Caldo preparado com TS ou BHI acrescido de 0,025% de sulfonato de polianetol de sódico (SPS), um inibidor químico e também anticoagulante. O frasco pediátrico de hemocultura deve conter 20 mL e o de adulto, 50 mL do meio. A diluição do sangue no caldo e a adição de SPS geralmente bastam para neutralizar as propriedades bactericidas do sangue. Comercialmente, há vários meios de cultura para hemocultura, inclusive para os sistemas de monitorização contínua automatizados, e a boa qualidade é essencial. A cada novo lote ou marca, como para todos os meios, deve-se proceder a um controle de qualidade. Ágar sangue: Acrescentar o sangue à base morna ( °C) e distribuir em placas. Para a observação da hemólise e alguns testes de identificação de S. pneumoniae, a recomendação é que o sangue seja de carneiro em Blood Agar Base.

44 Isolamento Meios de cultura Meio para hemocultura:
Caldo preparado com TS ou BHI acrescido de 0,025% de sulfonato de polianetol de sódico (SPS), um inibidor químico e também anticoagulante. Ágar sangue: Acrescentar o sangue à base morna ( °C) e distribuir em placas. Para a observação da hemólise e alguns testes de identificação de S. pneumoniae, a recomendação é que o sangue seja de carneiro em Blood Agar Base. Em doenças invasivas, o S. pneumoniae pode ser isolado de diferentes líquidos normalmente estéreis, como líquido cefalorraquidiano (LCR), sangue, líquidos pleural, ascítico e sinovial, e em secreções de abscessos, entre outros. Os meios de cultura apropriados são essenciais para o sucesso do isolamento e caracterização dos pneumococos e estão citados a seguir. Meios de cultura Base para os meios de cultura:  As bases recomendadas para o isolamento e subseqüente cultivo do pneumococo são meios complexos, como Müeller-Hinton (MH), Columbia, Trypticase Soy (TS), Brain Heart Infusion (BHI), Blood Agar Base (BAB). Quando sólidos, contêm ágar. Devem ser acrescidos de 5% ou 10% de sangue desfibrinado estéril de carneiro, coelho ou cavalo. Ágar chocolate: Este meio é rico e suporta as exigências nutritivas para o isolamento de S. pneumoniae, quando incubado em atmosfera de 5 - 7% CO2. Acrescenta-se à base aquecida a °C, 10% de sangue, freqüentemente de cavalo. Distribuir em tubos ou frascos inclinado ou em placas de Petri. Semear na sua superfície. Também é usado para conservação das bactérias por tempo curto, em torno de uma semana. Pode ser utilizado para o transporte, para o envio a outro laboratório, de preferência inclinado em frasco tipo penicilina bem vedado. Meio para hemocultura: Caldo preparado com TS ou BHI acrescido de 0,025% de sulfonato de polianetol de sódico (SPS), um inibidor químico e também anticoagulante. O frasco pediátrico de hemocultura deve conter 20 mL e o de adulto, 50 mL do meio. A diluição do sangue no caldo e a adição de SPS geralmente bastam para neutralizar as propriedades bactericidas do sangue. Comercialmente, há vários meios de cultura para hemocultura, inclusive para os sistemas de monitorização contínua automatizados, e a boa qualidade é essencial. A cada novo lote ou marca, como para todos os meios, deve-se proceder a um controle de qualidade. Ágar sangue: Acrescentar o sangue à base morna ( °C) e distribuir em placas. Para a observação da hemólise e alguns testes de identificação de S. pneumoniae, a recomendação é que o sangue seja de carneiro em Blood Agar Base.

45 Identificação Prova da optoquina
Finalidade: A optoquina (etil-hidrocupreína hidroclorídrica) é uma droga solúvel em água que se difunde rapidamente em meio de cultura sólido. Para este teste, em geral, utiliza-se o disco de optoquina de 6 mm contendo 5 µg da droga. O teste tem sensibilidade maior que 95%, sendo considerado de baixo custo e simples de ser realizado. Procedimento: Preparar uma suspensão do isolado em solução salina a 0,85% estéril com densidade ótica de 0,08 a 0,1 ao comprimento de onda de 625 nm, ou correspondente a 0,5 da escala de McFarland; Semear a suspensão em uma placa de ágar sangue de carneiro 5% de forma a obter crescimento confluente; Após a absorção da suspensão pelo meio de cultura, colocar um disco de optoquina na superfície do meio semeado, com o auxílio de uma pinça; Incubar a 35±2ºC e 5 - 7% de CO2 por h; Fazer a leitura do halo de inibição do crescimento bacteriano. Interpretação: Presença de halo ≥ 14 mm indica que a cultura é sensível à optoquina, sendo identificado para Streptococcus pneumoniae. Atenção: O pneumococo pode apresentar halos < 14 mm, como os estreptococos do grupo viridans. O teste da bile solubilidade deve então ser realizado. A identificação do pneumococo isolado em cultura é baseada na morfologia bacteriana e coloração de Gram, características do crescimento e reação hemolítica em placas de ágar sangue de carneiro a 5%, ausência de catalase e lise em presença de optoquina e de desoxicolato de sódio. A partir do crescimento em ágar chocolate, primo isolamento ou amostra transportada a outro laboratório: Semear em ágar sangue de carneiro 5% para obtenção de colônias isoladas; Efetuar picadas na superfície do meio para observar a hemólise sensível ao oxigênio; Incubar a 35±2ºC por h; Observar as características do crescimento: as colônias devem ser lisas, pequenas, brilhantes, acinzentadas, elevadas, podendo apresentar concavidade central, rodeadas por halo de hemólise parcial, com aspecto esverdeado. Um esfregaço corado pelo Gram deverá confirmar as características de diplococos com pontas em forma de lança, Gram-positivos; Repicar colônia bem isolada para ágar chocolate 10% e incubar a 35±2ºC por horas; Preparar esfregaço e corá-lo pelo Gram para verificar a pureza da cultura; Proceder às provas de identificação (optoquina e solubilidade em bile). A prova da catalase deve ser feita para caracterizar o gênero.

46 Identificação Teste da solubilidade em bile (desoxicolato de sódio a 2%) - Finalidade: Detergentes fracos, como os sais biliares desoxicolato de sódio ou taurocolato de sódio têm a capacidade de lisar seletivamente o S. pneumoniae em fase logarítmica do crescimento. Estes sais ativam as enzimas autolíticas (autolisinas) produzidas pelo pneumococo, acelerando a reação lítica natural da bactéria. O teste da bile-solubilidade pode ser realizado tanto em meio de cultura líquido como sólido. A turvação produzida por uma suspensão de pneumococo ficará completa ou parcialmente límpida ao se adicionar os sais biliares. Em meio sólido, as colônias bile-solúveis “desaparecem” em contato com algumas gotas de solução destes sais e o teste é um pouco mais difícil de ser visualizado. Quando se utiliza crescimento de cultura em caldo, deve-se ajustar o pH do meio para 7, para evitar reações falso-negativas devido à precipitação do desoxicolato de sódio em pH ácido (pH ≥ 6,5). - Procedimento: Preparar uma suspensão bacteriana densa a partir da cultura recente, que não tenha ultrapassado horas de incubação; Separar dois tubos de ensaio com transparência adequada para observar a presença de suspensão bacteriana. Marcar um com “C” (tubo controle) e outro com “T” (tubo teste); Adicionar solução de desoxicolato de sódio a 2% ao tubo “T” e solução salina a 0,85% ao tubo “C”. Os volumes em cada tubo devem ser iguais, pequenos, mas suficientes para fazer a leitura, por exemplo, 0,5 mL. Adicionar a cada tubo o mesmo volume, por exemplo, 0,5 mL da suspensão bacteriana; Homogeneizar e fazer a leitura imediatamente, após 1 h e até 2 h de incubação a 35±2ºC. - Interpretação: A leitura é feita de preferência contra um anteparo escuro, observando a turvação do tubo T em relação ao tubo C. Verificar se o tubo C apresenta uma suspensão homogênea da cultura em solução salina. Compará-lo com o conteúdo do tubo teste, contendo a cultura em desoxicolato de sódio. Se o tubo T apresentar turvação visivelmente menor que o controle ou estiver límpido, o teste é positivo e identifica Streptococcus pneumoniae; e confirmada a positividade, os tubos podem ser desprezados. Atenção: Se após 2 h não houver diferença entre os tubos, o teste é negativo e identifica Streptococcus do grupo viridans.

47 Identificação Teste de PYR (pyrrolidonil arilamidase)
- Finalidade: O teste de PYR determina a atividade da enzima pyrrolidonil arilamidase produzida pelo S. pyogenes, mas não pelos demais estreptococos β-hemolíticos. Colônias β-hemolíticas de enterococos podem ser confundidas com S. pyogenes, pois ambas apresentam positividade neste teste. - Procedimento: Com auxílio de uma pinça, retirar um disco de PYR do frasco e colocá-lo sobre uma lâmina ou placa de Petri vazia; Pingar uma gota de água destilada estéril (não utilizar salina, pois torna a reação mais lenta e menos intensa); Realizar um esfregaço com a bactéria a ser testada, recém-isolada, sobre o disco de PYR umidecido; Aguardar alguns minutos e colocar uma gota do reagente PYR. A reação ocorrerá em até 1 minuto. - Interpretação: Teste de PYR positivo apresenta o desenvolvimento de cor vermelha; O aparecimento de coloração amarela ou alaranjada indica resultado negativo; S. pyogenes e Enterococcus spp. são PYR positivos.

48 Identificação Teste de sensibilidade à bacitracina
- Finalidade: O teste tem a finalidade de diferenciar S. pyogenes de outras cepas do grupo A ou de outras espécies com colônias β-hemolíticas PYR positivas. - Procedimento: Um disco de 0,04 U de bacitracina é aplicado a uma placa de ágar sangue de carneiro que tenha um inóculo com 4 ou 5 colônias puras de Streptococcus spp., a ser testado. Incubar 12 horas (overnight) a 35± 2ºC. - Interpretação: A presença de qualquer halo de inibição ao redor do disco é interpretado como sensibilidade a bacitracina e indicativo de S. pyogenes.

49 Identificação Teste de CAMP
- Finalidade: O teste visa a identificação de cepas de S. agalactiae (grupo B). Estas cepas produzem o fator CAMP (Christie, Atkins e Munch-Petersen) que atua sinergicamente com a β-hemolisina produzida pelo Staphylococcus aureus em ágar sangue. - Procedimento: Semear um inóculo de Staphylococcus aureus ATCC (ou cepa de S. aureus com duplo halo de hemólise) de um ponto a outro da placa de ágar sangue; Semear perpendicularmente (90°) a colônia de Streptococcus β-hemolítico a ser testada, sem que haja o contato com a estria de Staphylococcus aureus; Incubar a 35±2ºC em atmosfera de 5% de CO2 por 48 h. - Interpretação: A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S.aureus na intersecção do crescimento das duas bactérias indica que o teste é positivo e indicativo de S.agalactiae; Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo e a cepa não pertence ao grupo B de Lancefield.

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51 Identificação Detecção direta de Streptococcus β-hemolíticos
A detecção direta de antígenos estreptocócicos tem sido utilizada para identificação de Streptococcus do grupo A em amostras de orofaringe. A amostra é coletada através de um swab e inoculada em uma solução de extração. Após um pequeno período de incubação, a suspensão de antígenos é detectada por métodos de aglutinação, enzima imunoensaios ou outros métodos. Falso negativo podem ocorrer em amostras contendo pequenas quantidades de Streptococcus spp., portanto testes negativos devem ser seguidos de cultura microbiológica. Testes rápidos para detecção de antígenos de Streptococcus do grupo B em amostras do trato urogenital também estão disponíveis comercialmente. A detecção direta de antígenos estreptocócicos tem sido utilizada para identificação de Streptococcus do grupo A em amostras de orofaringe. A sensibilidade do teste depende não apenas do método utilizado, mas também da quantidade de Streptococcus spp. presente na amostra. Este teste apresenta excelente especificidade, apesar de raramente detectar a presença de outros Streptococcus do grupo A que não o S. pyogenes, isto é, um teste falso positivo. A amostra é coletada através de um swab e inoculada em uma solução de extração. Após um pequeno período de incubação, a suspensão de antígenos é detectada por métodos de aglutinação, enzima imunoensaios ou outros métodos. Falso negativo podem ocorrer em amostras contendo pequenas quantidades de Streptococcus spp., portanto testes negativos devem ser seguidos de cultura microbiológica. Testes rápidos para detecção de antígenos de Streptococcus do grupo B em amostras do trato urogenital também estão disponíveis comercialmente, porém não apresentam a sensibilidade necessária para a detecção de baixos níveis de colonização e não são recomendados para a pesquisa destes agentes em gestantes.

52 Identificação Identificação sorológica Pneumococos
Permite identificar os sorotipos de pneumococo. O método clássico chama-se reação de Neufeld ou de Quellung. A reação é visualizada em microscópio ótico, com óleo de imersão e aumento de 1000X.

53 Identificação Identificação sorológica beta-hemolíticos
Permite identificar Estreptococos beta-hemolíticos Classificação de Lancefield Aglutinação em látex

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