Universidade do Sul de Santa Catarina - UNISUL Curso de Farmácia – Análises Clínicas Micologia Clínica Micologia Clínica Profª : Denise Esteves Moritz.

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1 Universidade do Sul de Santa Catarina - UNISUL Curso de Farmácia – Análises Clínicas Micologia Clínica Micologia Clínica Profª : Denise Esteves Moritz Abril/2007

2 Introdução A Candida sp é uma levedura comensal.
Infecções oportunistas em pacientes imunodeprimidos: candidíase. Langenbeck, em 1839 observou pela primeira vez a Candida albicans. Termo candidíase engloba as diversas doenças causadas pela Candida albicans e por outras leveduras relacionadas.

3 Características biológicas gerais de Candida
Introdução... Características biológicas gerais de Candida O gênero Candida compreende aproximadamente 200 espécies de leveduras, as quais reproduzem-se assexuadamente por brotamento. Algumas dessas espécies também apresenta a forma teleomórfica (sexual), na maioria das vezes ascosporogeneas. Apresentam capacidades assimilatórias oxidativas e fermentativas, por meio das quais tornam-se aptas a utilizarem uma variedade de substâncias orgânicas. Em adição a forma unicelular blastosporica (levedura), grande parte das espécies de Candida podem apresentar um estágio micelial com produção de micélio verdadeiro ou pseudomicélio. Em condições especiais in vitro algumas espécies, tais como, C. albicans e C. stellatoidea podem produzir clamidosporos.

4 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGIAS DESTE GRUPO DE FUNGOS
C. albicans é uma levedura diplóide com forma teleomórfica desconhecida., Sua morfologia, bem como de outras espécies do gênero, é caracterizada pela natureza dimórfica, incluindo a forma micelial e levedura. Essa mudança morfológica, o qual ocorre tanto in vivo quanto in vitro, é uma característica significante com implicações na patogênese e no diagnóstico das infecções causadas por esses fungos. Em condições in vitro, o blastosporo ou levedura pode ser obtido a partir de seu crescimento em meios de cultura sólido ou líquido. A obtenção da forma micelial ou pseudomicélio, bem como clamidosporo, é influenciada por vários fatores ambientais, tais como, alterações na composição de meios, adição de soro, crescimento sob condições semi-anaeróbico ou baixa tensão de CO2, pH baixo, e outros.

5 FATORES DE VIRULÊNCIA Poucas espécies de Candida estão implicadas em doenças humanas. Essas espécies apresentam diferentes habilidades patogênicas e baixa virulência, as quais podem ser isoladas a partir de várias formas clínicas, incluindo infecções sistêmicas graves. Muitos pesquisadores acreditam que os fatores de virulência incluem: (1) habilidade de aderir em tecidos hospedeiros, (2) potencial para produzir enzimas, principalmente, proteases e fosfolipases, e (3) capacidade de transformação morfológica, ou seja, uma forma que confere maior resistência contra o sistema de defesa do hospedeiro. A adesão dos microrganismos em tecidos hospedeiros é um pré-requisito para o desenvolvimento da infecção, como parte de um processo que protege os mesmos da remoção natural conferido pelo sistema de limpeza e defesa do hospedeiro.

6 Morfologia Morfologia da vida parasitária:
Blastoporos arredondados que apresentam brotamento; Alguns balstoporos alongam tornando-se pseudo-hifas; Em caso de Invasão tecidual, a C. albicans pode formar tubos germinativos. Morfologia da vida saprofítica: Em ágar Sabouraud as colônias são lisas, brilhantes e cremosas.

7 Morfologia A C. albicans tem como habitat a mucosa digestiva e vaginal. As espécies de Candida mais comumente implicadas em quadros clínicos são: Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei Outras espécies menos freqüentemente isoladas são: Candida rugosa Candida pseudotropicalis Candida guillermondii

8 Manifestações Clínicas
Mucosas mais atingidas: boca, esôfago e vagina. Quadros sistêmicos: invasão de vários tecidos As manifestações clínicas podem ser divididas em: 1. Candidíase cutâneo-mucosa 2. Candidíase sistêmica ou visceral 3. Candidíase alérgica

9 Candidíase Cutâneo-Mucosa
Atinge pele, unhas, mucosas orofaríngeas e genitais. 1. Candidíase cutânea Regiões de pregas de pele (intertrigo); inframamária; axilares; entre os dedos das mãos e dos pés; unhas (onicomicoses). Lesões eritematosas da pele com exsudato branco leitoso ou escamação. Prurido discreto ou intenso. Trabalhadores que necessitam imergir as mãos na água por longos períodos de tempo.

10 Candidíase Cutâneo-Mucosa
2. Candidíase oral Placas brancas na mucosa da boca ou faringe (sapinho). Locais mais comuns: bochechas, ponta da língua e palato mole. Comum em recém nascidos e em pessoas imunodeprimidas. 3. Candidíase gastrintestinal Lesões brancas,erosivas do esôfago e estômago, vistas por endoscopia Causam dor local que aumenta na deglutição.

11 Candidíase Cutâneo-Mucosa
4. Candidíase vulvovaginal Mucosas invadidas quando stress, diabetes, gravidez, antibioticoterapia, imunosupressão Secreção branco-leitosa, disúria, sensação de queimação, prurido intenso. 5. Onicomicoses Acomete principalmente a região periungueal da unha. Unhas edemasiadas, avermelhadas, dolorosas, com esxudato purulento.

12 Candidíase Sistêmica ou Visceral
Manifestação sistêmica da doença Fatores predisponentes: idade do paciente; imunidade; queimaduras; disseminação por via hematogênica Atinge um único órgão ou pode disseminar-se As manifestações clínicas são variáveis e não específicas, podendo haver quadros com sintomatologia cardíaca, respiratória, digestiva, hepática, renal, etc.

13 Candidíase Alérgica A produção de alguns metábolitos pela Candida pode desencadear manifestações alérgicas causando infecção em outro sítio anatômico. Quadros diversos, com lesões cutâneas encontradas entre os dedos das mãos.

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15 Onicomicose Blastomicética

16 Onicomicose Blastomicética

17 Candidíase interdigital

18 Candidíase vaginal

19 Candidíase oral

20 Candidíase infra mamária

21 Candidíase disseminada

22 Epidemiologia Aumento do número de espécies envolvidas que não C. albicans C. dublinienses: características morfológicas e bioquímicas são muito semelhantes a C. albicans. Encontradas no tubo gastrintestinal em 20 a 80% da população adulta saudável. Patogenicidade = Alterações nos mecanismos de defesa do hospedeiro. Em estudo realizado por Araújo et al. (2003) observou-se que 49% das onicomicoses daquela população eram causadas por leveduras do gênero Candida. Candidemia: mortalidade geral de 60% Atinge 94% dos pacientes com AIDS (Candidíase oral).

23 Epidemiologia – Fatores de risco
Uso de antibióticos de largo espectro; Tratamentos de quimioterapia de duração prolongada; Imunossupressão do sistema imunitário seguido de um transplante de órgãos; Procedimentos cirúrgicos resultantes de tratamentos hospitalares intensivos e prolongados; Hemodiálise e diálise interperitoneal em doentes imunocomprometidos; As infecções por leveduras tem também estado associadas à utilização de dispositivos médicos tais como implantes, cateteres vasculares, próteses dentárias, lentes de contacto, ligações artificiais, discos intervertebrais, entre outros.

24 Diagnóstico Material biológico: raspados das lesões cutâneas e das mucosas, expectoração, raspados das unhas, urina, sangue e biópsias, entre outros. Preparo: Preferencialmente, não utilizar medicamento tópico e antifúngico (sistêmico) nos 3 dias que antecedem o exame. Caso não possa suspender a medicação, anotar os medicamentos em uso nos últimos 7 dias. Em coleta de unhas: NÃO cortá-las e preferencialmente remover o esmalte, quando houver, um dia antes da coleta. Se o material clínico for enviado ao Laboratório, deve-se mantê-lo refrigerado, exceto pele, unha ou pêlo.

25 Diagnóstico – Exame Direto
À fresco, KOH 10% ou K-Tinta (15 a 20 min) Esfregaços corados pelo Gram, Papanicolaou, Giemsa, etc. São observados aglomerados de células leveduriformes (blastoconídeos) globosos ou ovais de parede lisa e pseudo-hifas ramificadas.

26 Diagnóstico – Exame Direto
Exame á fresco com KOH 10%

27 Diagnóstico – Exame Direto
Esfregaço corado pelo Gram

28 Diagnóstico – Exame Direto
Esfregaço corado pelo Papanicolaou

29 Diagnóstico – Esfregaço sangüíneo

30 Diagnóstico – Cultura Meios convencionais: Ágar Sabouraud
Ágar Sabouraud + cloranfenicol Ágar Sabouraud + cloranfenicol e cicloeximida Colônias de textura glabrosa e com relevo convexo, podendo apresentar variações de ceribriforme a rugosa; sua coloração varia do branco-amarelado ao laranja, aí se observando um reverso com a mesma coloração do verso e pigmento não difusível no meio.

31 Diagnóstico – Cultura

32 Diagnóstico - Cultura Meio diferencial:
CHROMágar Candida S 97,5% e E 97,6% Meio cromógeno, no qual cada espécie adquire uma cor característica para sua colônia Permite identificar as cepas de C. albicans que não produzem tubo germinativo ou clamidosporos C. albicans: verde esmeralda, cremosas, brilhantes C. tropicalis: azul rosado, halo ao redor C. krusei: rosa claro, rugosas

33 Diagnóstico – CHROMágar Candida
C. albicans

34 Diagnóstico – CHROMágar Candida
C. tropicalis

35 Diagnóstico – CHROMágar Candida
C. krusei

36 Diagnóstico - Micromorfologia
Cultivo em lâmina com Ágar fubá + Tween 80 Produção de clamidosporos de parede celular densa - Adaptação

37 Diagnóstico - Micromorfologia

38 Diagnóstico – Características fisiológicas
Bom crescimento em cicloeximida, até 42º C; Nitrato e urease negativas; Assimilam fontes de C e N; Fermentam glicose e maltose; Não fermentam lactose; Produção de clamidosporos em meios pobres para seu crescimento

39 Diagnóstico – Teste do tubo germinativo
Produção de tubo germinativo: a C. albicans produz o tubo germinativo em presença de soro (humano, fetal bovino) após 1-3 horas à 37º C.

40 Tratamento Remoção dos fatores que condicionam a infecção.
Depende da manifestação clínica. Manifestações orofaríngeas: violeta genciana diluída em solução aquosa (1/10.000). Nistatina: melhor terapêutica para todas as classes. Anfotericina B: para as formas mais graves (endocárdicas, cerebrais).

41 Caso Clínico A.C., 42 anos, sexo feminino. Reside em Tubarão (SC), onde é responsável pela lavagem de roupas em um hotel. Procurou o médico do posto de saúde próximo a sua casa relatando que há 3 meses vem sentindo dor a palpação nas unhas da mão direita e que a mesma encontra-se inchada e avermelhada na região de pele que circunda a unha. Ao exame clínico observou-se acometimento proximal e nos bordos da unha, sendo que a mesma apresentava-se com coloração castanho-amarelada, espessa e com manchas na superfície ungular até a parte distal, como mostra a figura abaixo.

42 Caso Clínico Além disso, ao ser questionada pelo médico relata que recentemente fez uso de corticosteróides por semanas, as unhas da mão sofreram traumatismo durante seu trabalho e trocou de manicure por que o alicate utilizado para remoção da cutícula não era esterilizado para uso e freqüentemente sua cutícula era machucada pela moça. Encaminhada ao LAC para realização do exame micológico e cultura da lesão obtiveram-se os seguintes resultados: Exame direto: presença de blastosporos em brotamento. Cultura em ágar Saubouraud: crescimento de colônias de coloração esbranquiçada, lisas, brilhantes e cremosas. Sobre o caso questiona-se: Qual a relação entre os aspectos relatados pela paciente e o surgimento da lesão micótica? Qual nome deve ser dado a esta onicomicose? Que outros procedimentos podem ser realizados para que chegue a um diagnóstico confirmatório de gênero e espécie? Como diferenciar este quadro de outro semelhante, porém causado por dermatófitos?

43 LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Paciente: Ana Hickmann Idade: 28 anos Solicitante: Dr. Fernando Alberto Haas – CRM/SC 4056 Data: 11/04/2005 Local da coleta: Laboratório Local da entrega: Laboratório Convênio: UNIMED Registro: 0001 EXAME MICOLÓGICO Material: raspado de unha da mão direita. EXAME DIRETO Clarificação e coloração: K-tinta Presença de aglomerados de células leveduriformes globosas (blastoconídeos) e pseudo-hifas ramificadas. CULTURA Meios convencionais Ágar saubouraud Ágar saubouraud cloranfenicol cicloeximida Presença de colônias de aspecto rugoso, cremosas e de tonalidade branco amarelada, com reverso da mesma coloração do verso e pigmento não difusível no meio. Meio diferencial CHROMágar Candida Presença de colônias de coloração verde esmeralda, sugestivo de Candida albicans. Braço do Norte/SC – Av Philliphi Schmidt, n° 1203, Centro – Fone/Fax: (048) 1

44 LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Paciente: Ana Hickmann Idade: 28 anos Solicitante: Dr. Fernando Alberto Haas – CRM/SC 4056 Data: 11/04/2005 Local da coleta: Laboratório Local da entrega: Laboratório Convênio: UNIMED Registro: 0001 CULTURA Microcultivo Ágar fubá + Tween 80 Presença de clamidoconídeos globosos, terminais, de parede celular espessa. Pseudomicélio e micélio verdadeiro abundantes, com muitos septos e blastoconídeos globosos reunidos em aglomerados ao longo da hifa. TESTE DO TUBO GERMINATIVO Método: inoculação em soro bovino a 37º C. Formação de tubo germinativo. Braço do Norte/SC – Av Philliphi Schmidt, n° 1203, Centro – Fone/Fax: (048) 2

45 LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Paciente: Ana Hickmann Idade: 28 anos Solicitante: Dr. Fernando Alberto Haas – CRM/SC 4056 Data: 11/04/2005 Local da coleta: Laboratório Local da entrega: Laboratório Convênio: UNIMED Registro: 0001 ASSIMILAÇÃO DE AÇÚCARES FERMENTAÇÃO DE AÇÚCARES Método: API 20 Método: API 20 Glicose : Positivo Glicose : Positivo Maltose : Positivo Maltose : Positivo Sacarose : Positivo Sacarose : Negativo Lactose : Negativo Lactose : Positivo Galactose : Positivo Galactose : Positivo Melibiose : Negativo Trealose : Positivo Celobiose : Negativo Urease : Negativo Melezitose : Negativo Xilose : Positivo Rafinose : Negativo Trealose : Positivo Dulcitol : Negativo Houve isolamento de Candida albicans. Data de saída: 11/05/2005. Farmacêutico Bioquímico Responsável CRF/SC 5642 Braço do Norte/SC – Av Philliphi Schmidt, n° 1203, Centro – Fone/Fax: (048) 3

46 Universidade do Sul de Santa Catarina - UNISUL Curso de Farmácia – Análises Clínicas Micologia Clínica Cryptococcus Alunas: Janea, Larissa, Manuela e Marisa Profª : Denise Esteves Moritz Abril/2005

47 Histórico Primeiro caso descrito na literatura médica ocorreu em 1894, quando Buschke relata o caso de um paciente com abcesso na tíbia. Em 1895, um outro pesquisador San Felice mostrou o poder deste fungo de causar de lesões cerebrais. Em 1935, Beham, define critérios morfológicos e identificação, utilizando na característica da espécie a denominação de Cryptococcus neoformans.

48 Definição Micose habitualmente subaguda ou crõnica, localizada na meníngea. Doença sistêmica que acomete órgãos profundos e a pele, com principal tropismo pelo SNC. Devido ao aumento de pacientes imunodeprimidos, relatou-se maior freqüência.

49 Agente etiológico O gênero Cryptococcus é composto por 19 espécies.
O C. neoformans var. neoformans e C. neoformans var. gatti, são as únicas espécies passíveis de causar quadros de criptococose. Outros: C. albidus C. lauretti C. tereus C. uniguttulatus

50 Habitat A fonte natural mais importante de var. neoformans são excrementos de pombos e outras aves, acumulados no solo por largo período de tempo. As partículas infecciosas podem ser células leveduriformes pequenas, transportadas pelo ar, ou resultantes de basidiosporos. A var. gatti costuma ser alongada, ovalada, enquanto a outra perfeitamente redonda.

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53 Manifestações clínicas
Assintomático O acometimento pulmonar é provavelmente freqüente. Pulmonar Apresenta sinais e sintomas semelhantes a um estado gripal. Também podem estar associadas algumas vezes a Tuberculose. Neurocriptococose A composição química do líquor serve como um exelente meio de cultura para o fungo. Os sintomas observados são: cefaléias, náuseas, vertigens, etc.

54 Manifestações clínicas
Disseminada A principal via de disseminação é a sangüínea, porém qualquer órgão pode ser comprometido. Cutânea primária Secundária a uma disseminação da infecção. Apresentam características bem definidas: pápulas, nódulos subcutâneos e celulite.

55 Diagnóstico laboratorial
O diagnóstico laboratorial da criptococose é baseado em três fundamentos: a demonstração do fungo no material clínico, o isolamento em cultura e a identificação final, e por fim, a pesquisa de antígenos circulantes.

56 Diagnóstico laboratorial
Demonstração do fungo no material clínico: é feita pela técnica da tinta da China ou nanquim. Preparo: o líquor deve ser centrifugado e com as duas primeiras gotas do sedimento faz-se o exame direto. É feita a homogeinização de uma gota da amostra com uma gota de nigrosina em uma lâmina com lamínula. Resultado: presença de estruturas blastoconidiadas, com 4 a 8m de diâmetro, capsuladas, redondas ou ovaladas, sugerindo a presença de Cryptococcus neoformans var. neoformans ou Cryptococcus neoformans var. gatti.

57 Diagnóstico laboratorial

58 Diagnóstico laboratorial

59 Diagnóstico laboratorial
Cultura: pode ser feita nos meios de ágar Sabourand com cloranfenicol, evitando apenas o cultivo em meio ágar Sabourand com cloranfenicol e cicloeximida. Preparo: é feito o repique, e os tubos podem ser incubados tanto em temperatura ambiente, entre 25 – 30ºC, (crescimento lento), como a 37ºC (crescimento rápido). Resultado: observam-se colônias com textura cremosa, intensamente mucóide, de coloração branco-amarelada, que tende para o marron com o passar dos dias, devido a formação de melanina.

60 Diagnóstico laboratorial

61 Diagnóstico laboratorial

62 Diagnóstico laboratorial
Identificação final: pode ser feita pela assimilação de carboidratos e incapacidade de fermentação, alta produção de urease e produção de pigmento melanóide, que confere cor às colônias.

63 Diagnóstico laboratorial

64 Diagnóstico laboratorial
Diagnóstico imunológico: é feito pela pesquisa de antígenos circulantes no líquor, através de testes de aglutinação em látex. As partículas de látex, são revestidas com globulinas anti-Cryptococcus neoformans, que aglutinam frente mínima concentração de antígeno presente na amostra. Altos títulos de antígeno são correlacionados com gravidade, e a sua diminuição corresponde a um bom prognóstico.

65 Caso Clínico C.S. 5 anos, há duas semanas começou a apresentar cefaléia, náuseas e febre moderada. A mãe preocupada procurou o médico e relatou-lhe que a filha, além dos sintomas citados, estava dormindo mal e sempre irritada. O médico solicitou uma punção lombar, como medida diagnóstica.

66 Caso Clínico Resultado: foi realizado o exame direto, que evidenciou a presença de leveduras capsuladas; Houve crescimento de colônias com textura cremosa, mucóide e de coloração marrom; No diagnóstico imunológico, através da aglutinação em látex, houve reação positiva.

67 LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Paciente: Carla de Souza Idade: 5 anos Solicitante: Dr. Fernando Alberto Haas – CRM/SC 4056 Data: 11/04/2005 Local da coleta: Hospital Infantil Joana de Gusmão Local da entrega: Laboratório de A. Clínicas Convênio: UNIMED Registro: 0002 EXAME MICOLÓGICO Material: líquor EXAME DIRETO Homogeneização de uma gota do líquor com uma gota de nigrosina. Presença de estruturas blastoconideanas, com 4 a 8 mm de diâmetro, capsuladas, redondas ou ovaladas. CULTURA Meios convencionais Ágar saubouraud Ágar saubouraud cloranfenicol Presença de colônias com textura cremosa, intensamente mucóide, de coloração branco-amarelada, que tende para o marrom. PROVAS BIOQUÍMICAS Urease: Positivo Braço do Norte/SC – Av Philliphi Schmidt, n° 1203, Centro – Fone/Fax: (048) 1

68 LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Paciente: Carla de Souza Idade: 5 anos Solicitante: Dr. Fernando Alberto Haas – CRM/SC 4056 Data: 11/04/2005 Local da coleta: Hospital Infantil Joana de Gusmão Local da entrega: Laboratório de A. Clínicas Convênio: UNIMED Registro: 0002 ASSIMILAÇÃO DE AÇÚCARES Método: API 20 Glicose : Positivo Maltose : Positivo Sacarose : Positivo Lactose : Negativo Galactose : Positivo Melibiose : Negativo Celobiose : Positivo Inositol : Positivo Xilose : Positivo Rafinose : Positivo Trealose : Positivo Dulcitol : Positivo Braço do Norte/SC – Av Philliphi Schmidt, n° 1203, Centro – Fone/Fax: (048) 2

69 LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Paciente: Carla de Souza Idade: 5 anos Solicitante: Dr. Fernando Alberto Haas – CRM/SC 4056 Data: 11/04/2005 Local da coleta: Hospital Infantil Joana de Gusmão Local da entrega: Laboratório de A. Clínicas Convênio: UNIMED Registro: 0001 EXAME IMUNOLÓGICO Método: aglutinação em látex. Soro reagente. Houve isolamento de Cryptococcus neoformans. Data de saída: 11/05/2005. Farmacêutico Bioquímico Responsável CRF/SC 5642 Braço do Norte/SC – Av Philliphi Schmidt, n° 1203, Centro – Fone/Fax: (048) 3