Cromatografia Liquida - CLAE

Apresentação em tema: "Cromatografia Liquida - CLAE"— Transcrição da apresentação:

1 Cromatografia Liquida - CLAE
UNISUL ANÁLISE INSTRUMENTAL Profa. Denise Esteves Moritz

2 O que é Cromatografia ? Definição:
A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária. A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenômeno de migração diferencial .

3 O que é Cromatografia a Líquido HPLC?
Definição: Na técnica de cromatografia a líquido a fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido . O processo cromatográfico acontece na fase líquida , sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos.

4 Instrumentação para HPLC

5 (Componentes retidos)
CLAE -HPLC Fase móvel (amostra) Fase estacionária (Componentes retidos) Migrações diferenciais Analitomov ⇋ Analitoest K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partição

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7 INSTRUMENTAÇÃO detector column injector oven pump One pump used to
MIXER detector column injector oven pump One pump used to control 4 reservoirs; mixing is done before pump. data processor Fase móvel

8 Instrumentação para HPLC
FM BOMBA DETECTOR COLUNA PURGA INJETOR

9 Componentes de um Cromatógrafo a Líquido HPLC
Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes principais : Injetor : É o dispositivo que tem a função de introduzir a amostra na fase móvel ; Coluna cromatografia : É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra ; Detector : É o dispositivo que tem a função de detectar os componentes eluídos da coluna cromatográficas

10 Componentes auxiliares de um HPLC
Bomba : É o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente ); É composta de um ou mais pistão acoplados a um sistema de válvulas. Fornece uma alta pressão.

11 BOMBA Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
Opções: Simples, gradiente binário, quaternário Mede a pressão sobre o sistema Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)

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13 Componentes auxiliares de um HPLC
Válvula de purga: É o dispositivo que permite a troca rápida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno. Misturador: É o dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluição .

14 Fase estacionária

15 Colunas Cromatográficas
Fases estacionárias : Sílica- C8 Sílica- C18 Sílica- C18 ( ODS) Sílica- NH2 Sílica- Diol Sílica Troca Iônica Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca Resinas DVB-ST porosas Pré-Coluna: É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica . Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.

16 COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
SÍLICA (suporte + usado): Resistência mecânica Variedade de forma, tamanho de partículas e poros - Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas - Superfície não homogênea

17 SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS
LIVRES GEMINAL VICINAIS influenciam no grau de acidez da sílica

18 Fase Estacionária A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica. São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas. Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0.

19 MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL
- QUIMICAMENTE LIGADAS - HÍBRIDAS - RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS

20 Fases Quimicamente Ligadas
média C18 (ODS) amostra forte C4 amostra fraca amostra

21 POLIMÉRICAS Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa - Maior estabilidade - Dificuldade de controlar reações entrecruzamento

22 (RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O  SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS Matriz orgânica-inorgânica (RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O  SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano - Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais - Menor quantidade de grupos de silanóis - Ultra-fast cromatografia

23 RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS
RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA - SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS

24 - Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte
- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte) Poli(etileno) Poli(butadieno) Poli(estireno) Poli(dimetilsiloxano) Poli(metiloctilsiloxano) Poli(metiloctadecilsiloxano) Poliéteres Polissacarídeos Poliaminas Polinucleotídeos Poliamidas Proteínas Sílica Zircônia Titânia Alumina

25 PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO) INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA

26 Fases estacionárias Interações C8 PH C2 van der Waals van der Waals

27 Fase Estacionária Fases estacionárias Interações CN NH2 2OH
Dipolo/Dipolo O H Si N C Ligação de hidrogênio

28 Fase Estacionária Fases estacionárias Interações PRS CBA SAX
Eletrostática H 3 + N SO - Si O (CH ) S Fases estacionárias Interações

29 Processo de Eluição Definição:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária. Série eluotrópica Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.

30 É uma medida da energia de adsorção do solvente
Força eluente: É uma medida da energia de adsorção do solvente Cromatografia com fase normal: Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar. Cromatografia com fase reversa: Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar.

31 DETECTORES - Classificação
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito UNIVERSAIS: Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS: Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química.

32 DETECTORES POLARÍMETRO UV MS IR ELETROQUÍMICO FLUORESCÊNCIA

33 Detectores Ultra violeta:
É mais comum, usado na CLAE. Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta. São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes.

34 Ultra violeta (UV-visível):
Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. Seletivo (moléculas com cromóforos) Comprimento de onda (λ) fixo λ pode ser selecionado (190 – 600 nm) Varredura (DAD) Solventes também absorvem Solvente λ nm Água MeOH ACN Acetona Hexano Clorofórmio THF 190 210 200 330 245 215

35 Fluorescência: Seletivo (moléculas que fluorescem)
Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV Seletivo (moléculas que fluorescem) Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas Mais sensível que UV por ser emissão Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente. Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila

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37 Detectores por Índice de Refração:

38 Indice de refração: Não- seletivo Sensível a variações de: Temperatura
Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna Não- seletivo Sensível a variações de: Temperatura Pressão Fluxo Composição fase móvel Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar Muito usado em cromatografia preparativa

39 Espectrometria de massas:
Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z) Destrutivo 1. uma amostra é carregado no instrumento do MS, e sofre vaporização. 2. os componentes da amostra são ionizados por um de uma variedade de métodos (por exemplo, impactando-as com um feixe de elétrons), que resulta na formação de partículas carregadas (íons) 3. os íons positivos são então acelerados por um campo elétrico 4. cálculo da relação massa-carga (m / z) das partículas com base nos detalhes do movimento dos íons em que o trânsito através de campos electromagnéticos e

40 Espectrometria de massas:
5. detecção dos íons, que na etapa 4 foram classificados de acordo com m / z. Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS) Interfaces de ionização mais comuns: ESI (ionização por electrospray), ApCI (ionização química à pressão atmosférica). Análise de micro e macromoléculas. Alta sensibilidade Fonte:

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42 MODOS DE SEPARAÇÃO NORMAL REVERSO TROCA IÔNICA

43 MECANISMO DE INTERAÇÃO:
MODO NORMAL MECANISMO DE INTERAÇÃO: ADSORÇÃO Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel Fase móvel: mistura de solventes orgânicos Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino

44 INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
MODO REVERSO INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA HIDROFOBICIDADE Fase estacionária: APOLAR Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO

45 Tempo de Retenção e Hidrofobicidade
OH C18 (ODS) Interação fraca forte OH

46 A hidrofobicidade será forte A hidrofobicidade será fraca
Se a amostra possui CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica : grupo aromático -COOH : grupo carboxílico -NH2 : grupo amino -OH : grupo hidróxi A hidrofobicidade será forte A hidrofobicidade será fraca

47 MECANISMO DE INTERAÇÃO :
TROCA IÔNICA MECANISMO DE INTERAÇÃO : ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas) Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura) Aniônicas: amônio quaternário, aminas Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico

48 Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L agulha (inox 316) êmbolo corpo (pirex) Obs: Seringa de HPLC

49 Seqüência Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos
Condicionamento da coluna com fase móvel Monitoramento da linha de base Injeção das amostras

50 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
FATOR DE RETENÇÃO (k) FATOR DE SEPARAÇÃO () NÚMERO DE PRATOS (N)

51 Cromatograma tR tM SINAL TEMPO
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)

52 A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:
TEMPO Efeitos do alargamento excessivo de picos: EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

53 BANDA CROMATOGRÁFICA w2 na linha de base

54 FATOR DE RETENÇÃO (k) tr – to tr = tempo retenção analito k
to = tempo morto da coluna Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases Não leva em conta o tempo morto da coluna

55 k1 = 1,3 k2 = 1,8 Se: t0 = 1,5 min t1 = 3,5 min t2 = 4,2 min

56 FATOR DE SEPARAÇÃO ()  k2 = k1 AVALIA A SELETIVIDADE

57  k2 = k1  = 1 não houve separação Se: k1 = 1,3 k2 = 1,8  = 1,38

58 NÚMERO DE PRATOS (N) tr N = 5,54 w0,5 Mede a eficiência do sistema
2 Mede a eficiência do sistema Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel

59 Eficiência da coluna (N)
Resolução é função da Seletividade () Eficiência da coluna (N) Fator de retenção (k)

60 Resolução Rs = 1.25 Rs = 1.05 Rs = 0.8

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62 FASE MÓVEL Solvente grau HPLC (alta pureza)
Filtração (membrana 0.45 μm) Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automático) Purgar os solventes

63 MODOS DE ELUIÇÃO ISOCRÁTICO:
Uma única composição de fase móvel ao longo da corrida; a composição ds FM é CONSTANTE. GRADIENTE: - Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo da corrida. - Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)

64 Mudança no modificador orgânico
b c d [ MeOH/H2O ] par crítico : c,d [ THF/H2O ] par crítico : a,b a b c d [ MeOH/THF/H2O ]

65 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE) EXTRAÇÃO: - LÍQUIDO-LÍQUIDO - LÍQUIDO-SÓLIDO - SOXHLET - FLUÍDO SUPER CRÍTICO - EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)

66 Filtração É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas de 0.45 mm mesh para a remoção do material insolúvel.

67 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante AMOSTRA PADRÃO Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito

68 ANÁLISE QUANTITATIVA A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector Cálculo de área:

69 ANÁLISE QUANTITATIVA Se ambos os compostos respondessem igualmente ao
detector poderíamos usar a relação: Massa A Área A Massa B Área B No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector.

70 PADRONIZAÇÃO EXTERNA Este método baseia-se na comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão. Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão:

71 PADRONIZAÇÃO EXTERNA Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração dessa substância na amostra. É importante salientar que o gráfico deve ser construído com concentrações próximas da concentração esperada na amostra. Outro fator muito importante é que o volume injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razão este tipo de padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado. Neste método não são usados fatores de correção para corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância

72 PADRONIZAÇÃO INTERNA Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração. Mx = massa do componente x Ma = massa da amostra Mp = massa do padrão Ap = área do padrão Ax = área corrigida do componente x

73 PADRONIZAÇÃO INTERNA A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. Deve ser também uma substância pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado à massa pesada Este método possibilita a determinação de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes.

74 APLICAÇÕES

75 APLICAÇÕES cont…

76 APLICAÇÕES cont…

77 TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel; VILEGAS, Wagner  and  ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinação de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp ISSN AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins Ribeiro6