Pirogênio e Endotoxina Bacteriana

Apresentação em tema: "Pirogênio e Endotoxina Bacteriana"— Transcrição da apresentação:

1 Pirogênio e Endotoxina Bacteriana
QUESTÕES DE PROVAS; CONTEÚDO DAS PRÓXIMAS AULAS; HORÁRIO DE ATENDIMENTO ON-LINE; blog do professor:

2 Histórico PIROGÊNIO E FEBRE
Embora o conhecimento científico que se tem sobre pirogênio tenha sido adquirido no últimos 50 anos, o estudo sobre a febre, especulações sobre suas causas, mecanismos e efeitos são tão antigos quanto a medicina, datando de mais de 2000 anos atrás. Os primeiros médicos gregos visualizavam a febre mais como mecanismo terapêutico que patofisiológico; Febre: mecanismo terapêutico ou patofisiológico

3 Histórico Injeções intravenosas de material pútrido
A ideia de que a febre pudesse ter valor terapêutico sobreviveu por séculos, sendo que inicialmente injeções intravenosas de material pútrido eram administradas a animais em caráter experimental;

4 Histórico VACINAS Salmonella typhi
Em etapa subsequente, preparações altamente pirogênicas preparadas de células mortas de Salmonella typhi foram empregadas como vacinas;

5 Histórico Pelletier e Caventou – XIX
Mas nem todos os autores viram a febre como benéfica: no início do século XIX, dois farmacêuticos franceses, Pelletier e Caventou, isolaram um antipirético, a quinina. Como resultado, estudos em animais permitiram conhecer os efeitos de pirexia e antitérmicos; Com o isolamento do antipirético quinina, estudos em animais permitiram conhecer os efeitos de pirexia e antitérmicos;

6 Histórico Porém, Billbroth foi o primeiro a usar o termo pyrogen, ou pirogênio, para descrever o princípio promotor de febre. Ele foi capaz de produzir a febre em cachorros injetando água destilada nestes animais; Panum Panum, um professor dinamarquês de fisiologia, investiu considerável tempo estudando a elevação térmica a partir de substâncias pútridas, e concluiu que a substância indutora de febre era termoestável, solúvel em água, insolúvel em álcool, diferente de bactérias vivas e que poucos miligramas injetados via intravenosa eram suficientes para induzir febre elevada; O termo pyrogen e substância pirogênica foi então usado por outros autores, entre os quais Burdon-Sanderson, que escreveram sobre o processo da febre originada de agente exógeno, como a bactéria, ou de origem endógena da célula do hospedeiro;

7 Histórico Durante a última década do século XIX, Centanni conduziu estudos significativos quanto aos agentes responsáveis pela febre; Entre outros, ele descreveu um procedimento para isolar a toxina bacteriana responsável pela ação febril; Mantendo cultura de bactérias Gram (-) sob autólise durante longos períodos, procedendo a sua filtração esterilizante e então submetendo-as a fracionamento em álcool, ele obteve pó branco altamente pirogênico, a partir de larga variedade de bactérias;

8 Histórico Este trabalho foi grandemente facilitado pela descoberta de Gram, em 1884; Os investigadores rapidamente aprenderam que endotoxinas estavam associadas exclusivamente a Gram (-);

9 Histórico Pseudomonas aeruginosa Salmonella sp.
Os microbiologistas demonstraram a seguir que as endotoxinas eram encontradas em muitas bactérias;

10 Histórico Porém, a eliminação de bactérias por esterilização térmica ou filtração não eliminava a pirogenicidade destas preparações; Na passagem do século, vários pesquisadores estavam preocupados com febre que às vezes acompanhava injeções, bem como outros efeitos colaterais associados à administração parenteral de agentes terapêuticos; Primeiro entendimento da febre das injeções – 1912 em investigações relatadas por Hort e Penfold;

11 Histórico Outros pesquisadores confirmaram as informações e enfatizaram a importância de evitar contaminação microbiana em todos os estágios da produção farmacêutica; Esterilidade Pirogenicidade Versus

12 Histórico Estudo colaborativo
Algum tempo depois um estudo colaborativo foi desenvolvido para estabelecer um sistema animal que pudesse ser usado para avaliar a pirogenicidade de soluções. Este estudo resultou no desenvolvimento do primeiro teste de pirogênio oficial em coelhos, que foi incorporado na USP XII, em 1942; Estabelecer um sistema animal que pudesse ser usado para avaliar a pirogenicidade de soluções; PRIMEIRO TESTE DE PIROGÊNIO OFICIAL, 1942 USP XII

13 Histórico Em paralelo, continuavam os esforços no sentido de purificar e caracterizar a endotoxina, tendo sido obtidos isolados pirogênicos por diferentes pesquisadores; Shear e Turner isolaram uma preparação de endotoxina de Serratia marcescens que apresentava tanto toxicidade quanto pirogenicidade e foram os primeiros a aplicar o termo lipopolissacarídeo ao extrato de endotoxina; Em 1952, Westphal e colaboradores publicaram trabalhos que detalham métodos de extração em água-fenol para a produção de lipopolissacarídeo (LPS) purificados, livres de proteínas, de diferentes enterobacteriáceas;

14 Histórico 1,0 ng/kg Respostas Febris
Estas preparações altamente purificadas causaram respostas febris em coelhos, mesmo em quantidades reduzidas, da ordem de 1,0 ng/kg, quando administradas por via intravenosa; Respostas Febris

15 Histórico Foram necessários 20 anos de trabalho desses autores, e outros pesquisadores, para demonstrar que a porção lipídica do LPS é responsável pelas reações biológicas induzidas pela endotoxina;

16 Pirogênio endógeno Oakley et al., 2011
O pirogênio endógeno (PE) é produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estímulo de pirogênios exógenos, e consiste em substância homogênea, sintetizada por diferentes células do hospedeiro após exposição ao pirogênio exógeno, sendo considerado o mediador primário da febre; Oakley et al., 2011

17 Pirogênio endógeno É interessante a presença frequente da febre em doenças malignas, o que se pode explicar como uma liberação espontânea de PE por alguns tipos de células tumorais;

18 Endotoxinas Constituem-se na mais significativa fonte de pirogênio para a indústria farmacêutica, quando não purificadas podem conter lipídeos, carboidratos e proteínas, mas quando purificadas são denominadas lipopolissacarideos (LPS); Apresentam uma região hidrofílica polissacarídea ligada covalentemente a uma região hidrofóbica, conhecida como lipídeo A; A região polissacarídea é altamente variável entre as espécies de bactérias Gram (-), já o lipídeo A é uma estrutura bastante conservadora, sendo responsável pela atividade biológica;

19 Atividade Biológica Muitas atividades biológicas são atribuídas à unidade lipídeo A da endotoxina: pirogenicidade, toxicidade letal, leucopenia, seguida de leucocitose, necrose da medula óssea, reabsorção do osso embrionário, ativação do complemento, queda de pressão sanguínea, agregação plaquetária, indução de resistência não específica à infecção, atividade de macrófagos, indução de síntese de IgG, indução à produção de interferon, indução à produção de TNF, gelificação do lisado do amebócito de Limulus; O mecanismo de indução da febre envolve a fagocitose do lipídeo A, sendo produzido pirogênio endógeno, que então atravessa a barreira hematoencefálica e age no hipotálamo;

20 Atividade Biológica Diferentemente da maioria dos animais e humanos, os ratos e camundongos apresentam resposta hipotérmica após administração parenteral de endotoxina; Usando o recurso de injeção direta nos ventrículos cerebrais, foi possível a promoção da febre, permitindo inferir que o centro termorregulador de ratos é capaz de responder ao lipídeo A; Demonstrando também que o lipídeo A, ou o pirogênio endógeno, injetados intravenosamente não atravessam a barreira hematoencefálica e a hipotermia decorre do efeito tóxico do lipídeo A sobre os vasos da pele;

21 Níveis Pirogênicos A questão de níveis pirogênicos torna-se crucial ao considerar os limites de liberação para os produtos farmacêuticos; 1980 – 50 pg/mL (0,5 ng/Kg); Posteriormente – 35 pg/mL; Sob evidência científica, 100 pg/mL é um limite de liberação aceitável para parenterais de grande volume e proporciona um significativo fator de segurança sobre o teste de pirogênio em coelhos;

22 Níveis Pirogênicos <<<<<<< 10 vezes
Embora se admita equivalência para dose-limite na reação pirogênica de coelhos e do homem, quando sob doses mais altas a relação dose-resposta observada no ser humano é mais intensa, podendo ser até 10 vezes maior; Esta diferenciação não implica desmérito no emprego do teste de pirogênio em coelhos, como preditivo do risco pirogênico para humanos;

23 Níveis Pirogênicos Mostrou-se que os níveis-limite em ambas as espécies ficam entre 0,1 e 0,14 ng/Kg para S. typhosa, 1,0 ng/Kg para E. coli, e de 50 a 70 ng/Kg para Pseudomonas sp; Vale ressaltar que os limites correspondem a preparações purificadas, enquanto as endotoxinas que ocorrem na natureza como contaminantes de produtos farmacêuticos apresentam comportamentos distintos; Assim, a pirogenicidade pode depender de qual a endotoxina estudada, assim como do nível da dose; 0,1 ng/mL permite um considerável fator de segurança quanto à pirogenicidade em humanos;

24 Processos de despirogenização
Inativação Remoção Endotoxinas A despirogenização pode ser obtida por inativação ou por remoção das endotoxinas; A inativação pode ser obtida pela detoxificação da molécula de lipopolissacarídeo LPS, usando tratamentos químicos que quebrem partes lábeis ou bloqueiem sítios necessários à atividade pirogênica, como alternativa pode ser usada alta temperatura;

25 Processos de despirogenização
Inativação Remoção Endotoxinas A remoção de endotoxinas pode também ocorrer por diferentes métodos, baseada em características físicas da endotoxina, como tamanho, peso molecular, carga eletrostática, ou afinidade da endotoxina com diferentes superfícies;

26 Despirogenização por Inativação da Endotoxina
Hidrólise Ácido-Base; Oxidação; Alquilação; Processo Térmico; Radiação Ionizante;

27 Despirogenização por Remoção de Endotoxinas
Lavagem; Destilação; Ultrafiltração; Osmose Reversa; Carvão Ativo;

28 Obtenção de Produtos Apirogênicos
Após a observação dos métodos despirogenizantes, por inativação ou remoção, ficam evidentes as limitações quanto à sua aplicação no produto terminado; Exceto nos métodos clássicos de obtenção de água apirogênica, assim como na aplicação de calor seco, em condições drásticas, a material termoestável (material de acondicionamento, por exemplo), os demais métodos são extremamente específicos, ou apenas se justificam em medicamentos ou produtos biológicos de altíssimo valor agregado;

29 Obtenção de Produtos Apirogênicos
Deve permanecer fortemente sedimentada a importância de trabalhar, durante todo o processo produtivo, em condições adequadas de higiene, relativamente a operadores e ao ambiente, além de empregar matérias-primas com baixas cargas microbianas, processos validados, pessoal qualificado e treinado. Em suma aplicar todos os conceitos de Boas Práticas de Fabricação, de forma que o produto seja obtido apirogênico no primeiro processamento, dispensando preocupações quanto a reprocessos ou tratamentos adicionais;

30 Obtenção de Produtos Apirogênicos
Todas as monitorações de processo, assim como testes de matérias-primas, com particular atenção às de origem natural, e do produto terminado, devem empregar técnicas analíticas validadas, seja com a metodologia clássica, empregando coelhos, ou diferentes métodos empregando a técnica in vitro do LAL;

31 Determinação de Endotoxinas
Lisado do amebócito de Limulus (LAL); Desde 1885 observou-se que o sangue do L. polyphemus, o caranguejo em forma de ferradura de cavalo, formava um coágulo em gel sólido, quando removido do animal; Vários aspectos dessa coagulação foram estudados, com particular referência aos amebócitos, a única célula circulante encontrada no sangue do Limulus; Em 1956, Bang verificou que bactérias Gram (-) eram capazes de fazer uma doença fulminante em caranguejos;

32 Determinação de Endotoxinas
Lisado do amebócito de Limulus (LAL); Esta doença era caracterizada por extensiva coagulação intravascular, e consequente morte; Em 1964, Levin e Bang apresentaram estudos sobre este mecanismo de reação, demonstrando que os amebócitos eram necessários para a reação e que os agentes de coagulação estão somente nos amebócitos; Assim, descreveram o fenômeno que mais tarde seria a base para o ensaio LAL;

33 Determinação de Endotoxinas