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1 BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOS São Paulo 2005 Projeto de Tese.

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1 1 BRUNO LEONARDO DE FREITAS SOARES EFEITOS DO ALPROSTADIL NA SÍNDROME DE ISQUEMIA E REPERFUSÃO EM TECIDO RENAL DE RATOS São Paulo 2005 Projeto de Tese apresentado à Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Mestre em Ciências

2 2 1. Introdução Contexto Bywaters, 1941 Bywaters, 1941 Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares traumáticas Descrição de síndrome associada a extensas lesões musculares traumáticas Haimovici, 1960 Haimovici, 1960 Síndrome metabólica pós-revascularização Síndrome metabólica pós-revascularização Haimovici, 1973 Haimovici, 1973 Síndrome mionefropática ou de reperfusão Síndrome mionefropática ou de reperfusão Burihan, 1982 Burihan, 1982 O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na síndrome O nível de obstrução e a massa muscular envolvida são importantes na síndrome Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1: Bywaters EGL, Beall D. Crush injuries with impairment of renal function. Br Med Journ 1960,;1: Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: Haimovici H. Arterial embolism with acute massive ischemic myopathy and myoglobinuria. Surgery 1960; 47: Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): Haimovici H. Miopathic nephrotic metabolic syndrome associated with massive acute arterial occlusion. Arch Surg 1999 nov; 18(5): Francisco JR, Burihan E. Tratamento das embolias aorto-iliacas. Revista de tema livre do 16 Congresso Brasileiro de Cirurgia 1982; p.79.

3 Contexto Myers, 1986 Myers, 1986 Injúria renal decorre da magnitude e da duração da isquemia Injúria renal decorre da magnitude e da duração da isquemia Joves, 1982 Joves, 1982 A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução tubular e necrose tubular aguda A isquemia leva ao edema intersticial com obstrução tubular e necrose tubular aguda Ward, 1988 Ward, 1988 Pouco progresso no tratamento a despeito do conhecimento Pouco progresso no tratamento a despeito do conhecimento Myers BD, Mran SM. Hemodinamically mediated acute renal failure. N Eng J Med 1986;314:97. Joves DB. Ultrastructure of acute renal failure. Lab Invest 1982;46:254. Ward MH. Factors predictive of acute renal failure in rhabomyolysis. Arch Int Med 1988; 148:

4 Contexto Granger, 1988 Granger, 1988 Radicais livres de oxigênio e lesão celular Radicais livres de oxigênio e lesão celular Vargas, 1995 Vargas, 1995 Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal reperfundido em ratos Efeito atenuante da PGE1 no tecido isquêmico renal reperfundido em ratos Kelly, 1996 Kelly, 1996 Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM1) Mecanismo direto e indireto de lesão celular: Molécula de adesão intercelular tipo 1 (ICAM1) Granger DN. Role of Xanthine oxidase and granulocytes in ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol 1988;225: Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6): Kelly KJ, Williams JR, Colvin RB, Bonventre JV. Antibody to intercellular adhesion molecule 1 deficient mice are protected against ischemic renal injury. J Clin Invest 1996;97:

5 Contexto Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1) Alprostadil: análogo da prostaglandina (PGE1) Vargas, 1995 Vargas, 1995 Bloqueio de substâncias quimioatrativas Bloqueio de substâncias quimioatrativas Linderman, 1998 Linderman, 1998 Diminuição da adesividade leucocitária Diminuição da adesividade leucocitária Gupta, 1998 Gupta, 1998 Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1 Diminuição da expressão das moléculas ICAM-1 Linderman, 1998 Linderman, 1998 Diminuição da resistência vascular periférica Diminuição da resistência vascular periférica Vargas AV. Krishnamuthi V, Masih R, Robinson AV, Schulak JA. Prostaglandin E1 attenuation of ischemic renal reperfusion injury in the rat. J AM Coll Surg 1995;180(6): Lindermann S, Gierer C, Darius H. Prostacyclin inhibits adhesion of polymorphonuclear leukocytes to human vascular endothelial cells due to adhesion molecule independent regulatory mechanisms. Basic Res Cardiol 2003 Feb;98(1)8-15. Gupta PC, Matsushita M, Oda K, Nishikimi N, Sakurai T, Nemura Y. Attenuation of renal ischemia-reperfusion injury in rats by alloprurinol and prostaglandin E1. Eur Surg Res 1998;30(2):102-7.

6 Hipótese O uso do alprostadil, por via intravenosa, atenua o efeito das lesões metabólicas e histológicas e imuno-histoquímicas na isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

7 Objetivo Avaliar os efeitos da infusão intravenosa do alprostadil num modelo experimental de isquemia e reperfusão em tecido renal de ratos

8 8 2. Métodos Projeto aprovado pelo comitê de ética da UNCISAL, protocolo 16-A, em13/10/ Tipo de estudo - Ensaio clínico aleatório em animais de experimentação - Ensaio clínico aleatório em animais de experimentação 2.2-Local Laboratório do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória - FMSP-BA

9 9 2. Métodos 2.3 –Amostra Ratos machos Ratos machos Linhagem OUT B Wistar Linhagem OUT B Wistar Idade - 90 a 120 dias Idade - 90 a 120 dias Peso a 350 g Peso a 350 g 15 dias - observação e adaptação 15 dias - observação e adaptação Condições controladas Condições controladas – Amostragem Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória da FMSP-BA Animais provenientes do biotério do Departamento de Cirurgia Experimental e Técnica Operatória da FMSP-BA

10 10 2. Métodos 2.4 Procedimentos Randomização - Envelopes - Sorteio aleatório - Examinadores

11 Procedimentos Grupos experimentais Grupo Sh (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento. Grupo Sh (10 animais ) – Realização de microcirurgia sem isquemia ou reperfusão. Infusão de Solução salina (SF 0,9%) atráves da veia jugular externa (V.J.E) após 1h e 30 minutos de procedimento. Grupo Ct ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão. Grupo Ct ( 10 animais ) – Procedimento microcirúrgico normal, com isquemia e reperfusão. Infusão de SF 0,9% antes da reperfusão. Grupo Al ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão. Grupo Al ( 10 animais ) – Procedimento idêntico ao Grupo II, exceto pela infusão de 20microgramas/kg Alprostadil, antes da reperfusão. 2. Métodos

12 Procedimentos Modelo experimental Pré operatório Foram submetidos a jejum (6h) Foram submetidos a jejum (6h) Foram devidamente pesados Foram devidamente pesados Submetidos a sorteio Submetidos a sorteio Anestesia Fenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitoneal Fenobarbital sódico (45mg/kg) via intraperitoneal Sono profundo Sono profundo Estímulos dolorosos irresponsivos Estímulos dolorosos irresponsivos Doses complementares de anestésico Doses complementares de anestésico

13 Procedimentos Modelo Experimental Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa Dissecção, isolamento e cateterização da veia jugular externa Tricotomia ventral abdominal com lâmina de barbear Tricotomia ventral abdominal com lâmina de barbear Incisão abdominal mediana Incisão abdominal mediana Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do segmento abdominal até acima das artérias renais Abordagem transperitoneal da aorta, com isolamento do segmento abdominal até acima das artérias renais Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al) Oclusão da aorta supra-renal por 30 minutos(Grupos Ct e Al) Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al) Liberação do clampe e reperfusão 1 h (Grupos Ct e Al) No Grupo Sh não há isquemia e reperfusão No Grupo Sh não há isquemia e reperfusão

14 Procedimentos Modelo Experimental Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Alprostadil (Grupo Al), antes da reperfusão Infusão de SF 0,9% (Grupo Ct) e Alprostadil (Grupo Al), antes da reperfusão Amostras de sangue Amostras de sangue Nefrectomia esquerda e preparo das peças Nefrectomia esquerda e preparo das peças Eutanásia – dose anestésica letal Eutanásia – dose anestésica letal

15 Procedimentos

16 Procedimentos Modelo experimental Estudo histológico (microscopia ótica) Hematoxilina eosina Ácido Periódico de Schiff (PAS) ) Azul patente (Azul de Alcion) Estudo Imunohistoquímico (Laboratório de biologia molecular da Fiocruz-Salvador) Amostras de Tecido Renal

17 Variáveis primárias Estudo imunohistoquímico Dosagem de Molécula de adesão intercelular do tipo 1 (ICAM-1) Dosagem de Molécula de adesão intercelular do tipo 1 (ICAM-1) Análise qualitativa de desarranjo estrutural Análise qualitativa de desarranjo estrutural

18 Variáveis primárias Tecido renal sem isquemiaTecido renal com isquemia e reperfusão

19 Procedimentos Grau I Grau II

20 Procedimentos Grau III Grau IV

21 Variáveis primárias Estudo histológico Jablonski, 1983 Grau 0: Normal Grau 0: Normal Grau 1: Mitoses e necrose de células individualmente Grau 1: Mitoses e necrose de células individualmente Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos contorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveis Grau 2: Necrose de células adjacentes aos túbulos contorcidos proximais, porém sendo estes ainda viáveis Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo contorcido proximal. Desarranjo estrutural moderado Grau 3: Necrose confinada ao terço distal do túbulo contorcido proximal. Desarranjo estrutural moderado Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo contorcido proximal com desarranjo estrutural severo intersticial Grau 4: Necrose abrangendo todas as porções do túbulo contorcido proximal com desarranjo estrutural severo intersticial

22 Variáveis primárias Estudo histológico Estudo histológico

23 Variáveis primárias Estudo histológico Grau I Grau II

24 Variáveis primárias Estudo histológico Grau III Grau IV

25 Variáveis secundárias Avaliação bioquímica sérica Desidrogenase lática Leucometria Desidrogenase lática Leucometria Creatina-fosfoquinase Potássio Creatina-fosfoquinase Potássio Lactato Hemogasimetria Lactato Hemogasimetria Uréia Uréia Sódio Sódio Creatinina Creatinina Cálcio Cálcio

26 Cálculo do tamanho da amostra Análise estatística Análise de variância por postos de Kruskal Wallis Análise de variância por postos de Kruskal Wallis Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentes Teste de Mann-Whitney para duas amostras independentes P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de nulidade P = 0,05 ou 5% Nível de rejeição da hipótese de nulidade 2.6- Modelo Estatístico

27 27 3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias Gráfico 1. Distribuição dos graus de necrose entre os grupos

28 28 3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias Gráfico 2. Análise Imunohistoquímica entre os grupos

29 29 3. Resultados 3.3 Variáveis Primárias Gráfico 3. Comparativo da análise histológica entre os grupos

30 30 3. Resultados 3.1 Caracterização da amostra Gráfico 4. Médias do pesos dos ratos dos três grupos de tratamento. Grupo Sh Grupo Ct Grupo Al

31 31 3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias Gráfico 5. Comparação dos níveis de eletrólitos dos três grupos de tratamento.

32 32 3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias Gráfico 6. Comparação de LDH e CPK dos três grupos de tratamento. Grupo Al

33 33 3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias Gráfico 7. Comparação da Gasometria (pO2 e pCO2) dos três grupos de tratamento. AlprostadilControle SF0,9%

34 34 3. Resultados 3.3 Variáveis secundárias Gráfico 8. Comparação de Lactato e Uréia dos três grupos de tratamento. Alprostadil

35 35 4. Conclusões O Alprostadil, na dose de 20 microgramas/kg, atenua as repercussões imunohistoquímicas e histológicas em tecido renal de ratos submetidos a um modelo experimental de isquemia e reperfusão com clampeamento aórtico supra-renal O Alprostadil, na dose de 20 microgramas/kg, atenua as repercussões imunohistoquímicas e histológicas em tecido renal de ratos submetidos a um modelo experimental de isquemia e reperfusão com clampeamento aórtico supra-renal Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na dose de 20 microgramas/kg, não foi capaz de modificar as alterações metabólicas pelos parâmetros utilizados neste estudo Exceto pelos níveis de CPK, o Alprostadil na dose de 20 microgramas/kg, não foi capaz de modificar as alterações metabólicas pelos parâmetros utilizados neste estudo


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