Diferenciação genética em populações de Anopheles

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1 Diferenciação genética em populações de Anopheles
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA Diferenciação genética em populações de Anopheles Root, 1926 (Diptera: Culicidae) do Estado do Amazonas, usando marcadores RAPD-PCR darlingi ANA PAULA BARBOSA DA SILVA Joselita Maria Mendes dos Santos, Dra. Wanderli Pedro Tadei, Dr. Orientador(es) MANAUS AMAZONAS

2 INTRODUÇÃO

3 Considerações gerais sobre a Malária
INTRODUÇÃO Considerações gerais sobre a Malária Doença parasitária causada por protozoários do gênero Plasmodium, que são transmitidos pela picada do mosquito fêmea do gênero Anopheles (SWEENEY, 1999); Caracteriza-se por acessos de febre com intervalos de 24, 48 ou 72 horas. A forma mais virulenta é causada pela espécie Plasmodium falciparum; Continua sendo a principal parasitose, causando de 1,5 a 2,7 milhões de mortes/ano, 4% da mortalidade total mundial; Região amazônica: principal vetor da malária – Anopheles darlingi.

4 Considerações gerais sobre
INTRODUÇÃO Considerações gerais sobre Anopheles darlingi Classe: Insecta COSTA (2005) Ordem: Diptera Família: Culicidae Gênero: Anopheles Subgênero: Nyssorhynchus DOGGETT (2002) FORATTINI, 2002 FORATTINI, 2002 DOGGETT (2002)

5 INTRODUÇÃO Ocorre desde o México - Argentina, e Alpes Andinos - América do Sul (FORATTINI, 1962); Costuma picar o homem no intradomicílio. Mas, em algumas situações pode picar no peridomicílio; Atualmente - uma espécie monotípica. Estudos prévios sobre a biologia indicaram a presença de populações geograficamente distintas e diferentes padrões na atividade de picar (Malafronte et al., 1999).

6 RAPD-PCR- DNA Polimórfico amplificado ao acaso
INTRODUÇÃO RAPD-PCR- DNA Polimórfico amplificado ao acaso Williams et al. (1990) – variação da técnica PCR – utiliza apenas 1 “primer”; Primer – 10 oligonucleotídeos; Vantagens (Williams et al., 1990): Não necessita do conhecimento prévio do genótipo do organismo a ser estudado; Possibilita um maior número de marcadores possíveis de serem mapeados; Permite de maneira rápida identificar o grau de similaridade entre os genótipos (inter e intra-específicos).

7 Estudos em anofelinos usando RAPD
INTRODUÇÃO Estudos em anofelinos usando RAPD Wilkerson et al. (1995) – A. albitarsis, procedentes do Paraguai, Argentina, Brasil e Venezuela; Dimopoulos et al. (1996) – A. gambiae; Manguin et al. (1999) – A. darlingi, procedentes de Belize, Bolívia, Brasil, Guiana Francesa e Venezuela.

8 OBJETIVOS

9 Objetivos Específicos
Objetivo Geral Analisar a variabilidade genética intra e interpopulacional de Anopheles darlingi, procedentes de localidades ao longo dos rios Negro e Solimões (AM), usando marcadores moleculares de RAPD. Objetivos Específicos Analisar a variabilidade genética intra e peridomiciliar, e tentar correlacionar com a capacidade vetorial e a adaptabilidade da espécie; Identificar a presença de possíveis variantes alélicas que possam estar separadas por barreiras geográficas (rios Negro e Solimões); Estabelecer o nível de variância molecular entre as populações;

10 Comparar dois protocolos de extração de DNA.
OBJETIVOS Determinar os índices de similaridade e distância genética a partir do índice de Nei (1978); Verificar a função dos rios Negro e Solimões como agentes mantenedores e propiciadores da diversidade genética desses insetos na Amazônia; Comparar dois protocolos de extração de DNA.

11 MATERIAL E MÉTODOS

12 PROCEDÊNCIA E OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS
MATERIAL E MÉTODOS PROCEDÊNCIA E OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS Figura 1 - Mapa do Estado do Amazonas

13 MATERIAL E MÉTODOS Transportadas para o Laboratório de Malária e Dengue (INPA) – Repasto sanguíneo com hamster (Mesocricetus auratus), isoladas para postura; Mosquitos criados em insetário – Temperatura 26ºC ± 1ºC – Umidade 80 a 90% - Algumas desovas foram mantidas até 4ºestádio larval, outras até o estágio adulto – Congelamento a -70ºC; Identificação dos mosquitos – Gorham et al. (1967) e Consoli & Lourenço-de-Oliveira (1994); SILVA, 2006

14 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO
MATERIAL E MÉTODOS EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO Procedimentos de Wilkerson et al. (1995) – algumas modificações; QUANTIFICAÇÃO DO DNA Espectrofotômetro específico para DNA; Absorbância entre 260 a 280nm – Diluição de 1:35 (2µL DNA/68µL água milli-q autoclavada); Modelo Gene Quant Pro – Marca Pharmacia; SILVA, 2006

15 AMPLIFICAÇÃO A 94ºC – 1min 45 ciclos 36ºC – 1min 72ºC – 2min
MATERIAL E MÉTODOS AMPLIFICAÇÃO A 45 ciclos 94ºC – 1min 36ºC – 1min 72ºC – 2min 72ºC – 7min SILVA, 2006

16 PRIMER AM 05: 5’ G T G A C G T A G C 3’ AM 08:
MATERIAL E MÉTODOS PRIMER Selecionados – Sanguino & Santos (2002). AM 05: 5’ G T G A C G T A G C 3’ AM 08: 5’ G T T G C G A T C C 3’ AM 09: 5’ G G A C T G G A G T 3’

17 CORRIDA ELETROFORÉTICA
MATERIAL E MÉTODOS CORRIDA ELETROFORÉTICA Gel de Agarose (1,5%) DNA + Azul de Bromofenol Cuba Eletroforética SILVA, 2006

18 Aparelho de Fotodocumentação
MATERIAL E MÉTODOS Aparelho de Fotodocumentação Eagle Eye II (Stratagene) – UV nm

19 MATERIAL E MÉTODOS ANÁLISE ESTATÍSTICA Análise da variabilidade genética – Programa Tools for Population Genetics Analyses (TFPGA) – opção de Marcadores Dominantes para Organismos Diplóides (MILLER, 1997) – cada banda um loco; Estimativa da freqüência alélica – raiz quadrada das freqüências de bandas ausentes observadas; Dendrograma de similaridade – índice de Nei (1978), método não ponderado de agrupamento de pares de populações com média aritmética (UPGMA);

20 Resultados Parciais

21 Resultados Parciais 2,072 pb 1,500 pb 600 pb
M C M 2,072 pb 1,500 pb 600 pb Figura 1. Perfil da variabilidade genética em populações de A. darlingi do Estado do Amazonas. M=marcador molecular (Ladder 100pb) e C=Controle. Amostras: 1 a 5 (S. Gabriel da Cachoeira), 6 a 10 (Coari), 11 a 14 (Tabatinga) e 15 a 18 (Manaus).

22 Resultados Parciais 2,072 pb 1,500 pb 600 pb
M I P I P I P I P I P I P I P I P I P C M 2,072 pb 1,500 pb 600 pb Figura 2. Perfil da variabilidade genética em populações de A. darlingi da Cidade de Manaus, de acordo com a atividade de picar. M = Marcador molecular (Ladder 100pb) e C = Controle. Amostras: I = Intradomicílio e P = Peridomicílio.

23 Número médio de amostras por loco Heterozigosidade média
Resultados Parciais Tabela 1 – Estimativa da variabilidade genética em quatro populações de A. darlingi no Estado do Amazonas. População Número médio de amostras por loco Percentagem de locos polimórficos * Heterozigosidade média Observada Esperada ** S. Gabriel Cachoeira* 29,09 81,82 0,2569 0,2615 Coariº 30,00 90,91 0,3204 0,3259 Tabatingaº 29,39 0,2849 0,2898 Manaus* 25,45 78,79 0,2784 0,2841 Freqüência do alelo mais comum menor ou igual a 0,95; **Estimativa não enviesada (Nei, 1978). * = Rio Negro; º = Rio Solimões

24 Resultados Parciais Tabela 2 – Matriz de similaridade e distância genética entre as populações de A. darlingi do Estado do Amazonas*. População 1 2 3 4 1. S. Gabriel da Cachoeira ***** 0,9068 0,9167 0,9514 2. Coari 0,0979 0,9895 0,9703 3. Tabatinga 0,0870 0,0105 0,9787 4. Manaus 0,0498 0,0301 0,0215

25 Resultados Parciais Figura 3. Dendrograma agrupando as populações de A. darlingi do Estado do Amazonas, com base na distância genética. Método não ponderado de agrupamento de pares de populações com média aritmética - UPGMA (Nei, 1978).

26 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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29 TADEI, W. P. ; SANTOS, J. M. M. ; RABANNI, M. B
TADEI, W.P.; SANTOS, J.M.M.; RABANNI, M.B. Biologia de Anofelinos Amazônicos. V. Polimorfismo cromossômico de Anopheles darlingi Root (Diptera: Culicidae). Acta Amazonica, v.12, n.2, p , 1982. WILKERSON, R.C.; PARSON, T.J.; KLEIN, T.A.; GAFFGAN, T.V.; BERGO, E.; CONSOLIM, J. Diagnosis by random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction of four cryptic species related to Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis (Diptera: Culicidae) from Paraguay, Argentina end Brazil. Journal of Medicine and Entomology, v.32, n.5, p , 1995. WILLIAMS, J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; TINGY, S.V. DNA polymerase amplified by arbitrary primers are used as genetic markers. Nucleic Acids Research, v.18, n.22, p , 1990.

30 MUITO OBRIGADA!!!!