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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA ANA PAULA BARBOSA DA SILVA MANAUS - AMAZONAS Joselita.

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS ESCOLA SUPERIOR DE SAÚDE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA ANA PAULA BARBOSA DA SILVA MANAUS - AMAZONAS Joselita Maria Mendes dos Santos, Dra. Wanderli Pedro Tadei, Dr. Orientador(es)

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3 Doença parasitária causada por protozoários do gênero Plasmodium, que são transmitidos pela picada do mosquito fêmea do gênero Anopheles (SWEENEY, 1999); Caracteriza-se por acessos de febre com intervalos de 24, 48 ou 72 horas. A forma mais virulenta é causada pela espécie Plasmodium falciparum; Continua sendo a principal parasitose, causando de 1,5 a 2,7 milhões de mortes/ano, 4% da mortalidade total mundial; Região amazônica: principal vetor da malária – Anopheles darlingi.

4 Classe: Insecta Classe: Insecta Ordem: Diptera Ordem: Diptera Família: Culicidae Família: Culicidae Gênero: Anopheles Gênero: Anopheles Subgênero: Nyssorhynchus Subgênero: Nyssorhynchus DOGGETT (2002) COSTA (2005) FORATTINI, 2002 DOGGETT (2002) FORATTINI, 2002

5 Ocorre desde o México - Argentina, e Alpes Andinos - América do Sul (FORATTINI, 1962); Costuma picar o homem no intradomicílio. Mas, em algumas situações pode picar no peridomicílio; Atualmente - uma espécie monotípica. Estudos prévios sobre a biologia indicaram a presença de populações geograficamente distintas e diferentes padrões na atividade de picar (Malafronte et al., 1999).

6 Williams et al. (1990) – variação da técnica PCR – utiliza apenas 1 primer; Primer – 10 oligonucleotídeos; Vantagens (Williams et al., 1990): Não necessita do conhecimento prévio do genótipo do organismo a ser estudado; Não necessita do conhecimento prévio do genótipo do organismo a ser estudado; Possibilita um maior número de marcadores possíveis de serem mapeados; Possibilita um maior número de marcadores possíveis de serem mapeados; Permite de maneira rápida identificar o grau de similaridade entre os genótipos (inter e intra-específicos). Permite de maneira rápida identificar o grau de similaridade entre os genótipos (inter e intra-específicos).

7 Wilkerson et al. (1995) – A. albitarsis, procedentes do Paraguai, Argentina, Brasil e Venezuela; Manguin et al. (1999) – A. darlingi, procedentes de Belize, Bolívia, Brasil, Guiana Francesa e Venezuela. Dimopoulos et al. (1996) – A. gambiae;

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9 Analisar a variabilidade genética intra e interpopulacional de Anopheles darlingi, procedentes de localidades ao longo dos rios Negro e Solimões (AM), usando marcadores moleculares de RAPD. Analisar a variabilidade genética intra e peridomiciliar, e tentar correlacionar com a capacidade vetorial e a adaptabilidade da espécie; Identificar a presença de possíveis variantes alélicas que possam estar separadas por barreiras geográficas (rios Negro e Solimões); Estabelecer o nível de variância molecular entre as populações;

10 Comparar dois protocolos de extração de DNA. Determinar os índices de similaridade e distância genética a partir do índice de Nei (1978); Verificar a função dos rios Negro e Solimões como agentes mantenedores e propiciadores da diversidade genética desses insetos na Amazônia;

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12 Figura 1 - Mapa do Estado do Amazonas

13 Transportadas para o Laboratório de Malária e Dengue (INPA) – Repasto sanguíneo com hamster (Mesocricetus auratus), isoladas para postura; SILVA, 2006 Mosquitos criados em insetário – Temperatura 26ºC ± 1ºC – Umidade 80 a 90% - Algumas desovas foram mantidas até 4ºestádio larval, outras até o estágio adulto – Congelamento a -70ºC; Identificação dos mosquitos – Gorham et al. (1967) e Consoli & Lourenço- de-Oliveira (1994);

14 Espectrofotômetro específico para DNA; Absorbância entre 260 a 280nm – Diluição de 1:35 (2µL DNA/68µL água milli-q autoclavada); Modelo Gene Quant Pro – Marca Pharmacia; SILVA, 2006 Procedimentos de Wilkerson et al. (1995) – algumas modificações;

15 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 94ºC – 1min 36ºC – 1min 72ºC – 2min 72ºC – 7min 45 ciclos SILVA, 2006

16 AM 05: 5 G T G A C G T A G C 3 AM 08: 5 G T T G C G A T C C 3 AM 09: 5 G G A C T G G A G T 3 Selecionados – Sanguino & Santos (2002).

17 SILVA, 2006 Gel de Agarose (1,5%) DNA + Azul de Bromofenol Cuba Eletroforética

18 Aparelho de Fotodocumentação Eagle Eye II (Stratagene) – UV nm

19 Análise da variabilidade genética – Programa Tools for Population Genetics Analyses (TFPGA) – opção de Marcadores Dominantes para Organismos Diplóides (MILLER, 1997) – cada banda um loco; Estimativa da freqüência alélica – raiz quadrada das freqüências de bandas ausentes observadas; Dendrograma de similaridade – índice de Nei (1978), método não ponderado de agrupamento de pares de populações com média aritmética (UPGMA);

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21 2,072 pb 1,500 pb 600 pb Figura 1. Perfil da variabilidade genética em populações de A. darlingi do Estado do Amazonas. M=marcador molecular (Ladder 100pb) e C=Controle. Amostras: 1 a 5 (S. Gabriel da Cachoeira), 6 a 10 (Coari), 11 a 14 (Tabatinga) e 15 a 18 (Manaus). M C M M C M

22 M I P I P I P I P I P I P I P I P I P C M M I P I P I P I P I P I P I P I P I P C M Figura 2. Perfil da variabilidade genética em populações de A. darlingi da Cidade de Manaus, de acordo com a atividade de picar. M = Marcador molecular (Ladder 100pb) e C = Controle. Amostras: I = Intradomicílio e P = Peridomicílio. 2,072 pb 1,500 pb 600 pb

23 População Número médio de amostras por loco Percentagem de locos polimórficos * Heterozigosidade média Observada Esperada ** S. Gabriel Cachoeira* 29,0981,820,25690,2615 Coariº30,0090,910,32040,3259 Tabatingaº29,3981,820,28490,2898 Manaus*25,4578,790,27840,2841 Freqüência do alelo mais comum menor ou igual a 0,95; **Estimativa não enviesada (Nei, 1978).Freqüência do alelo mais comum menor ou igual a 0,95; **Estimativa não enviesada (Nei, 1978). * = Rio Negro; º = Rio Solimões Tabela 1 – Estimativa da variabilidade genética em quatro populações de A. darlingi no Estado do Amazonas.

24 Tabela 2 – Matriz de similaridade e distância genética entre as populações de A. darlingi do Estado do Amazonas*. População S. Gabriel da Cachoeira *****0,90680,91670, Coari 0,0979*****0,98950, Tabatinga 0,08700,0105*****0, Manaus 0,04980,03010,0215*****

25 Figura 3. Dendrograma agrupando as populações de A. darlingi do Estado do Amazonas, com base na distância genética. Método não ponderado de agrupamento de pares de populações com média aritmética - UPGMA (Nei, 1978).

26 HARTL, D.L. A primer of populations genetics. Sunderland: Inc. Publisher p. FORATTINI, O.P. Entomologia Médica. São Paulo: Faculdade de Higiene e Saúde Pública p. DIMOPOULOS, G.; ZHENG, L.; KUMAR, V.; TORRE, A.D.; KAFATOS, F.C.; LOUIS, C. Integrated genetic map of Anopheles gambiae: use de RAPD polymorphisms for Genetic, Cytogenetic and STS Landmarks. Genetics, v.143, p , CONSOLI, R.A.G.B.; LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, R. Principais mosquitos de importância sanitária no Brasil. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz p. DYE, C. Vectorial capacity: must be measured all its components? Parasitology Today, v.2, p , FERREIRA, M.E.; GATTAPAGLIA, D. Introdução ao Uso de Marcadores Moleculares em Análise Genética. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN p. GORHAM, J.R.; STOJANOVICH, C.J.; SCOTT, H.G. Clave ilustrada para los Mosquitos Anofelinos de Sudamérica Oriental. Atlanta: Comunicable Disease Center, United States Public Health Service p. GUBLER, D.J. Resurgent vector-borne diseases as a global health problem. Emerging Infectious Diseases, v.4, n.3, p , GUEDES, A.S.; AMORIN, E.M.; SCHREIBER, G. Análise dos cromossomos salivares em anofelinos brasileiros. Revista Brasileira de Malária e Doenças Tropicais, v.9, p , 1957.

27 MARELLI, M.T. Anopheles oswaldoi (Diptera: Culicidae): análise do segundo espaçador interno transcrito (ITS2) do DNA ribossômico e da susceptibilidade à infecção com Plasmodium vivax p. Tese (Instituto de Ciências Biomédicas) - Universidade de São Paulo, São Paulo. KREUTZER, R.D.; KITZMILLER, J.B.; FERREIRA, E. Inversion polymorphism in the salivary gland chromosomes of Anopheles darlingi Root. Mosquitoes News, v.32, p , HILL, S.M.; CRAMPTON, J.M. DNA-based methods for the identification of insect vetors. Annal of Tropical Medicine and Parasitology, v.88, p , MANGUIN, S.; WILKERSON, R.C.; CONN, J.E.; RUBIO-PALIS, Y.; DANOFF-BURG, J.A.; ROBERTS, D.R. Population structure of the primary malaria vector in South America, Anopheles darlingi, using isozyme, random amplified polymorphic DNA, internal transcribed spacer 2, and morphologic markers. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.60, n.3, p , MILLER, M.P. Tools for population genetic analyses (TFPGA): A Windows program for the analysis of allozyme and molecular population genetic data, version 1.3. Arizona: Northern Arizona University NEI, M. Estimation of average heterozigosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, v.89, p , RABANNI, M.B.; SEAWRIGHT, J.A.; LEATHERWOOD, L.B. A method for culturing single families of Anopheles albimanus. Mosquitoes News, v.36, n.1, p , RAFAEL, M.S.; TADEI, W.P. Heterocromatin variation in chromosomes of Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root and A. (N.) nuneztovari Gabaldón (Diptera: Culicidae). Genetics and Molecular Biology, v.23, n.1, p.67-70, RAFAEL, M.S.; TADEI, W.P. Metaphase karyotypes of Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root and A. (N.) nuneztovari Gabaldón (Diptera: Culicidae). Genetics and Molecular Biology, v.21, n.3, p , 1998.

28 SINGER, B.H.; CASTRO, M.C. Agricultural colonization and malaria on the Amazon frontier. Annals of the New York Academy of Science, v.954, p , ROOT, F.M. Studies on Brazilian mosquitoes. I. The anophelines of the Nyssorhynchus group. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v.6, p , SANTOS, J.M.M. Aspectos biológicos e isoenzimáticos de Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root, 1926 (Diptera: Culicidae) p. Dissertação (Ciências Biológicas) - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia / Universidade do Estado do Amazonas, Manaus. ____________. Variabilidade genética em populações naturais de Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root, 1926 (Diptera: Culicidae) p. Doutorado (Ciências Biológicas) - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia / Universidade Federal do Amazonas, Manaus. SANTOS, J.M.M.; CONTEL, E.P.B.; KERR, W.E. Biologia de Anofelinos Amazônicos. II. Ciclo biológico, postura e estádios larvais de Anopheles darlingi Root, 1926 (Diptera: Culicidae) da Rodovia Manaus/Boa Vista. Acta Amazonica, v.11, p , ______________. Esterases isozymes in Anopheles darlingi. Acta Amazonica, v.15, n.1/2, p , SANTOS, J.M.M.; TADEI, W.P.; CONTEL, E.P.B. Ontogeny of esterases, leucine aminopeptidase and alfa-glycerophosphate dehydrogenase in Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root, 1926 (Diptera: Culicidae). Revista Brasileira de Biologia, v.56, n.3, p , SCHREIBER, G.; GUEDES, A.S. Cytological aspects of the taxonomy of Anophelines (Subgenus Nyssorhynchus). Bulletin World Health Organization, v.24, p , _______________. Perspectivas citológicas na sistemática dos anofelinos (S.G. Nyssorhynchus). Revista Brasileira de Malária e Doenças Tropicais, v.12, p , SWEENEY, A.W. Prospects for control of mosquito-borne diseases. Journal of Medicine and Microbiology, v.48, p , 1999.

29 TADEI, W.P.; SANTOS, J.M.M.; RABANNI, M.B. Biologia de Anofelinos Amazônicos. V. Polimorfismo cromossômico de Anopheles darlingi Root (Diptera: Culicidae). Acta Amazonica, v.12, n.2, p , WILLIAMS, J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; TINGY, S.V. DNA polymerase amplified by arbitrary primers are used as genetic markers. Nucleic Acids Research, v.18, n.22, p , WILKERSON, R.C.; PARSON, T.J.; KLEIN, T.A.; GAFFGAN, T.V.; BERGO, E.; CONSOLIM, J. Diagnosis by random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction of four cryptic species related to Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis (Diptera: Culicidae) from Paraguay, Argentina end Brazil. Journal of Medicine and Entomology, v.32, n.5, p , 1995.

30 MUITO OBRIGADA !!!!


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