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Florianópolis, junho de 2011 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA DISCIPLINA: BIOQUÍMICA.

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1 Florianópolis, junho de 2011 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA DISCIPLINA: BIOQUÍMICA BÁSICA BQA5109 Replicação e Transcrição do DNA

2 O Material Hereditário dos Cromossomos São Segmentos de DNA (genes) Cada célula carrega em seu núcleo as instruções para a formação de um indivíduo completo... Quando uma célula se divide, cada célula leva uma cópia do DNA original ORGANISMO CÉLULA NÚCLEO CROMOSSOMOS (DNA+PROTEÍNAS) Possui a informação que, em última análise, dita a função de uma proteína; Características celulares são determinadas pelas proteínas que a célula produz; Capacidade de autoduplicação. DNA

3 DNA Possui a Informação Para Codificar Proteínas e RNAs Origem a um novo ser com características semelhantes ao original... DNA confere a base molecular da hereditariedade! Cada célula carrega no seu DNA as instruções para a formação de um indivíduo completo Quando a célula se divide, as células filhas levam uma cópia dessa informação

4 Relembrando: O DNA Dupla-Hélice Estrutura Química Modelo Espacial Polímero de desoxirribonucleotídeos de 4 espécies dispostos em duas fitas de sentidos opostos (ANTIPARALELAS). A estrutura de dupla-fita é mantida por pontes fosfodiéster (que unem nucleotídeos numa mesma fita) e ligações do tipo ponte de hidrogênio que ligam as bases COMPLEMENTARES entre as fitas.

5 A Estrutura do DNA Fornece as Bases da Hereditariedade A cópia do material hereditário é possível graças a natureza complementar das fitas do DNA (pareamento de bases)... Replicação: processo de biossíntese de DNA onde, a partir de uma molécula de DNA pré-existente formam-se duas moléculas filhas contendo uma das fitas da molécula mãe original. PROCESSO SEMICONSERVATIVO

6 A Replicação é Semi-Conservativa Cada dupla-hélice filha é composta de uma fita velha (conservada) e uma fita nova (recém-sintetizada) A replicação produz duas moléculas completas e idênticas a partir de uma molécula de DNA original Características importantes

7 Em relação a Estrutura e ao processo de Replicação do DNA é CORRETO afirmar: (A)O DNA é uma molécula composta por polímeros de desoxirribonucleotídeos, dispostos em duas fitas, sendo ambas idênticas entre si. (B)Em relação ao pareamento de bases do DNA, bases púricas fazem ligação do tipo ponte de hidrogênio com outra base púrica na fita oposta na dupla-hélice. (C)Ligações do tipo fosfodiéster são responsáveis por manter as duas fitas do DNA unidas, auxiliando na estabilidade da molécula. (D)A replicação do DNA é dita semi-conservativa porque as duas novas moléculas de DNA idênticas, são sintetizadas a partir de uma molécula antiga. (E)A replicação do DNA é dita semi-conservativa porque cada fita na dupla-hélice do DNA novo possui uma fita nova (recém-sintetizada) e uma fita antiga (conservada).

8 Replicação – Ocorre Durante a Intérfase do Ciclo Celular

9 GLAST (EAAT1) GLT-1 (EAAT2) Replicação do DNA 1. Iniciação Os locais onde o DNA é aberto são chamados de origens de replicação e são marcados por uma seqüência particular de nucleotídeos. A dupla-hélice do DNA é muito estável e proteínas auxiliam na separação das duas fitas DNAa – Ligam-se a segmentos do DNA ricos em A=T e faz com que o DNA se dissolva, as fitas separam-se, formando regiões de DNA de fita simples; 2 – Proteína de Ligação do DNA de Fita Simples (SSB) – Mantém a separação das fitas e protegem o DNA de nucleases que clivam DNA de fita simples; 3- DNA-Helicase – Liga-se ao DNA de fita simples e a seguir move-se na região vizinha de dupla- fita, forçando as fitas a se separarem, desenrolando a dupla-hélice (requer ATP). Não atuam em locais aleatórios

10 Replicação do DNA 1. Iniciação

11 A síntese do DNA novo ocorre nas zonas ou forquilhas de replicação e é bidirecional...

12 Replicação do DNA 2. Alongamento da cadeia DNA-Polimerase – Sintetiza a nova fita usando uma das fitas velhas como molde e catalisa a adição de nucleotídeos à fita de DNA em crescimento, verificando se foram corretamente incorporados. DNA-polimerase O pareamento de bases entre o desoxirribonucleotídeo que entra e os da fita-molde guia a formação de uma nova fita de DNA, complementar na seqüência de nucleotídeos à fita molde.

13 Replicação do DNA 2. Alongamento da cadeia DNA-polimerase catalisa a adição de nucleotídeos à extremidade 3`-OH de uma fita de DNA nova pela formação de uma ligação fosfodiéster com o grupo 5`-fosfato do nucleotídeo que está sendo incorporado Nova cadeia é sintetizada sempre na direção 5` 3` Os nucleotídeos entram na reação como nucleosídeos trifosfatados de alta energia e há quebra da ligação fosfoanidrido A DNA-polimerase permanece associada ao DNA e move-se ao longo da cadeia (3 5) durante a polimerização

14 Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase Necessita de um Primer O mecanismo de polimerização do DNA apresenta dois problemas... Solução: Uma enzima chamada primase sintetiza um PRIMER (10 nucleotídeos) de RNA 1. A DNA- polimerase precisa de um grupo 3'-OH para estender a cadeia de DNA Ribonucleotídeos Como se inicia a síntese de DNA? Ao final do processo de replicação o primer é removido

15 Como é possível sintetizar as fitas novas sobre um molde que está na direção oposta (5` 3`) ? Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase 2. A enzima DNA-polimerase só sintetiza fitas novas na direção 5` 3`, fazendo a leitura da fita molde na direção 3` 5`; Cada fita possui uma polaridade única (são antiparalelas) Ambas as novas fitas parecem crescer na mesma direção

16 Replicação do DNA – Enzima DNA-Polimerase Não existe síntese na direção 3' 5' !!! Solução: O problema é solucionado por uma manobra da enzima. A fita que deveria crescer no sentido 3' 5' é feita descontinuamente, em pequenos pedaços, com a DNA- polimerase trabalhando para trás a partir da forquilha de replicação. Os fragmentos são posteriormente unidos (DNA-ligase), formando uma fita contínua.

17 Replicação do DNA – Fita contínua (líder) e Fita Descontínua (atrasada)

18 Síntese de uma fita contínua a partir de fragmentos... Replicação do DNA 3. Terminação O primer de RNA é alongado pela DNA- polimerase III até que outro RNA seja encontrado O primer de RNA é removido pela DNA-polimerase I (atividade 5` 3` exonuclease) e a lacuna é preenchida com desoxirribonucleotídeos pela própria enzima (atividade 5` 3` polimerase) A quebra restante é ligada pela DNA-ligase catalisa a ligação fosfodiéster final entre os grupos 5-fosfato da cadeia de DNA sintetizada pela DNA- polimerase III e o grupo 3-OH da cadeia feita pela DNA-polimerase I.

19 Resumindo... Uma maquinaria de replicação, que envolve proteínas e enzimas, sintetiza o novo DNA A DNA-polimerase é a enzima responsável pela polimerização do novo DNA A seqüência de nucleotídeos de uma nova fita do DNA é ditada pela fita molde As fitas novas são sintetizadas em direções opostas (contínua e descontínua) A polimerização sempre ocorre na direção 5` 3` Fragmentos são unidos e duas fitas contínuas são formadas Um primer de RNA é utilizado na síntese da nova fita (e posteriormente removido)

20 Dogma Central da Biologia Molecular

21 Relembrando: O RNA Polímero de 4 tipos de ribonucleotídeos (4 tipos) unidos por ligação fosfodiéster, existente como fita simples RNAm RNAr RNAt

22 Características Essenciais da Transcrição Altamente Seletiva: de acordo com o tipo celular, para algumas regiões do DNA muitos transcritos são feitos enquanto que, para outras, poucos transcritos são feitos. RNA´s podem sofrer várias modificações: Adições terminais, desbastes, remoção de segmentos internos e junções. Estas modificações convertem o transcrito primário em uma molécula funcional.

23 Transcrição – Visão Geral Transcrição: Processo de síntese do RNA, que utiliza uma das fitas do DNA com molde. 1 – Desenrolamento, abertura da dupla-hélice e exposição das bases de cada fita do DNA 2 - A seqüência de NT da fita do RNA é determinada pela seqüência de NT da fita molde do DNA. 3- Os ribonucleotídeos incorporados são covalentemente ligados à cadeia em formação do RNA em uma reação catalisada por enzima. A cadeia nova de RNA é produzida sempre na direção 5` 3`e os ribonucleotídeos são adicionados um por vez, de acordo com os nucleotídeos presentes na fita de DNA usada como molde. A enzima responsável pelo processo é a RNA-POLIMERASE

24 Transcrição – A RNA-Polimerase Funções na Transcrição: 1. Reconhece sítios de iniciação (sítios promotores) no DNA; 2. Desespiraliza um curto trecho da dupla hélice do DNA próximo a ela, liberando um molde de fita única; 3. Seleciona o ribonucleosídeo fosfato correto e catalisa a formação de uma ligação fosfodiéster; este processo é repetido muitas vezes à medida que a enzima se move ao longo do DNA; 4. Detecta sinais de terminação; 5. Interage com ativadores e repressores que modulam a velocidade da transcrição. Enzima multimérica. Catalisam a formação de pontes fosfodiéster que unem os nucleotídeos. Percorre o DNA, estendendo a fita nova de RNA na direção 5` 3`. Utiliza nucleosídeos trifosfatos (NTP) que, através da ruptura de suas ligações fosfoanidrídicas, fornecem a energia que impulsiona a reação

25 A RNA polimerase utiliza NTP como precursores e adiciona NMP à extremidade 3´ da ribose da cadeia de RNA em crescimento. Transcrição – A RNA-Polimerase A RNA-polimerase... Os nucleotídeos se unem através de uma ligação 3´-5´fosfodiéster, entre -OH de C 3 da ribose de um nucleotídeo e -PO 4 - do nucleotídeo adjacente. A RNA-polimerase faz uma cópia de RNA a partir de um molde de DNA !!!

26 Transcrição – A RNA-polimerase

27 Etapas na Síntese de RNA – 1. INICIAÇÃO INICIAÇÃO: Envolve a ligação da RNA-polimerase a uma região do DNA que determina a transcrição de um gene em particular. Esta região é conhecida como REGIÃO PROMOTORA. Região Promotora I = Caixa de Pribnow = Sequência TATAAT –10. Situada 10 nucleotídeos à esquerda da primeira base do sítio de início da transcrição. Região Promotora II = Sequência - 35 = Sequência TTGACA. Situada 35 nucleotídeos à esquerda da primeira base do sítio de início da transcrição.

28 5- A T G C C A G T A G G C T A C G G T C A T C C G A U G C C A G U A G G C - 3 (DNA) Fita codificadora (DNA) Fita molde RNA A enzima RNA-polimerase utiliza a fita 3 5 do DNA como molde, produzindo uma fita de RNA na direção 5 3. A fita molde do DNA é antiparalela e complementar à fita codificadora do DNA e ao RNA. A região promotora não se localiza na fita molde... Etapas na Síntese de RNA – 1. INICIAÇÃO O RNA sintetizado possui, portanto, a mesma direção que a fita codificadora e U no lugar de T.

29 Etapas na Síntese de RNA – 2. ALONGAMENTO Alongamento: Uma vez que a região promotora tenha sido reconhecida, a RNA- polimerase começa a sintetizar o transcrito e a subunidade sigma é liberada; A RNA-polimerase desenrola a fita, expondo uma nova região de fita molde e adiciona ribonucleotídeos à nova fita de RNA, na direção 5` 3`. A nova seqüência de nucleotídeos é determinada pela fita molde do DNA

30 Etapas na Síntese de RNA – 3. TERMINAÇÃO Terminação: O alongamento continua até um sinal de terminação ser atingido... OBS: Em alguns casos, uma proteína adicional (fator rô) pode ser requerida para a liberação do transcrito. No final, RNA-polimerase e o transcrito são liberados...

31 Transcrição em Eucariotos Transcrição em Eucariotos: Mais complexa que em Procariotos e algumas etapas ainda não são bem compreendidas. Além do reconhecimento de uma região promotora (CAAT e TATA Box), diversos fatores de transcrição complementares ligam-se a sítios no DNA, regulando o processo.

32 Modificação Pós-Transcricional do RNA = identidade do RNA Após a formação do transcrito primário, os RNA´s são modificados e este transcrito inativo transforma-se em uma molécula funcional. RNA Ribossômico

33 RNA Transportador Modificação Pós-Transcricional do RNA Nucleotidil-transferase

34 Modificação Pós-Transcricional do RNA RNA Mensageiro Facilita a iniciação da tradução e auxilia a estabilizar a molécula Adição de CAP 5` e de uma Cauda poli-A: Geralmente idêntico ao transcrito primário em procariotos, mas é muito modificado nos eucariotos. Auxilia na estabilização do RNAm e facilita sua saída do núcleo. guanidil transferase Guanina-7-metil-transferase Poli-A-polimerase

35 Modificação Pós-Transcricional do RNA RNA Mensageiro Remoção de Íntrons: A funcionalidade do RNAm eucariótico pode envolver a remoção de seqüências de RNA (íntrons) que não codificam proteínas. As seqüências restantes (exons) são unidas para formar o RNA maduro. Catalisado por enzimas snRNPs (pequenas partículas de ribonucleoproteína nuclear) que são formadas por Proteína + RNA Permite que muitos genes possam ser processados, produzindo RNAm diferentes, dependendo do tipo da célula no qual o gene está sendo expresso ou o estágio de desenvolvimento 1 gene proteínas

36 Resumo...


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