ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR

Apresentação em tema: "ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR"— Transcrição da apresentação:

1 ENGENHARIA GENÉTICA BIOLOGIA MOLECULAR
André Fioravante Guerra

2 CONCEITOS O QUE É DNA? O QUE ELE FAZ?
PORQUE ELE É VITAL EM SERES VIVOS? COMO PROMOVER MODIFICAÇÕES NELE? REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE (PCR) TÉCNICA DE CLONAGEM (DNA RECOMBINANTE) SELEÇÃO DE BACTÉRIAS COMPETENTES

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4 Cada nucleosídeo é ligado a um grupo fosfato formando um nucleotídeo
Cada base nitrogenada é ligada à molécula de açúcar formando um nucleosídeo EXISTE UM ATOMO CENTRAL DE FOSFORO LIGADO A 4 ATOMOS DE OXYGENIO Cada nucleosídeo é ligado a um grupo fosfato formando um nucleotídeo

5 Bases Nitrogenadas Quatro bases de DNA A= Adenina T= Timina G= Guanina
C= Citosina U = uracil (RNA) Bases Nitrogenadas Purinas Estruturas da cadeias cíclicas: Anel duplo 5 e 6 C & N Pirimidinas Estruturas de anel único contendo 6 átomos C & N

6 Açúcar Deoxiribose RNA DNA

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8 O QUE ELE FAZ???

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11 O “dogma central” da biologia molecular
Proposto por Francis Crick em Em 1970 publicado na revista Nature DNA codifica para produção de RNA RNA codifica para produção de proteina. Proteina não codifica para produção de proteina, RNA ou DNA. O final nas palavras de Francis Crick “Once information has passed into protein, it cannot get out again”.

12 Conceitos Básicos GENOMA: todo DNA existente num organismo
GENE: um segmento de DNA que codifica um produto funcional proteínas ou RNAs

13 COMO?

14 TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO
Dependente de fator protéico ENVOLVE A PROTEINA rho

15 LOCALIZAÇÃO DO PROMOTOR
ATG

16 PROMOTORES DE GENES BACTERIANOS

17 tRNA tRNAs tem cerca de 80 bases,
Existem ao menos 31 no citoplasma, 22 na mitocôndria. Todos os tRNAs tem um braço aceptor com uma sequência 3′ CCA, que é covalentemente ligada ao aminoácido. (A) Posuem um triplet anticodon que transientemente se liga ao mRNA. (B) A estrutura geral é denominada trevo (cloverleaf ) A B

18 Ativação dos aminoácidos
AA Ativação dos aminoácidos tRNA Amino acil tRNA sintetases: ligação dos aminoácidos à extremidade 3’ do tRNA de acordo com o anti-códon braço do anti-codon AAs Uma única amino acil tRNA sintetase liga um Aminoácido a todos os seus tRNAs

19 Três passos na Tradução: Iniciação
1. A subunidade menor do rRNA se liga ao mRNA via sequência líder próxima ao start codon (AUG).

20 Código Genético

21 Tradução: aa livre Ribossomo Proteína tRNA 5’ 3’
Gly Ribossomo Phe His Glu Asp Proteína Met Ala Cys tRNA 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A Molécula de mRNA codon Direção do avanço do ribossomo

22 A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Gly Phe His Glu Asp Met Ala Cys 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

23 A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Gly Phe His Glu Met Ala Cys Asp 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

24 A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
His Gly Phe Met Ala Cys Asp Glu 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

25 A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Ile Met Ala Cys Asp Glu His Gly Phe 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

26 A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Lys Met Ala Cys Asp Glu Phe Ile His Gly 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

27 A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly Lys Ile His 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

28 A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Lys Ile 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A

29 G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Leu Lys 5’ 3’ G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A

30 U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Met Leu 5’ 3’ U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A

31 G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Asn Met 5’ 3’ G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G

32 G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Pro Asn 5’ 3’ G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C

33 U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Gln Pro 5’ 3’ U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A

34 G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ 3’ G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A

35 C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A
Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ STOP 3’ C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A

36 A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A A A A
Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ STOP 3’ A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A A A A

37 A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ STOP 3’ A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C

38 A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C
Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Gln Lys Pro Leu Asn Met 5’ 3’ A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C

39 VARIAÇÃO GENÉTICA =POLIMORFISMO Muda a forma e função
A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A A T A C Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Gln Lys Pro Leu Asn Met 5’ 3’ Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Gln Lys Pro Leu Asn CYS Muda a forma e função 5’ 3’ A U A A A A U U A A U G A A C AA A C A A U A A T A C

40 A replicação in vivo Replicação é semi-conservativa e a polimerização deve ser sempre no sentido 5´→3´ Mas o DNA é antiparalelo ou seja, uma fita ocorre no sentido 5’ → 3’ e a outra no sentido 3’ → 5’ Como ocorre então a replicação nos dois sentidos?

41 Forquilha de replicação do DNA
Proteínas de iniciação identificam a origem da replicação (rica em A-T) participam da ligação da DNA helicase ao DNA As fitas se mantêm separadas durante a replicação graças à ação de umas proteínas as Single-strand binding proteins – SSBP’s A proteína de iniciação acoplada à DNA helicase abre o DNA na junção “Y”. As pontes de H se rompem e a molécula se abre como um zíper

42 História do PCR Em 1993, Kary Mullis, um químico ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método em 1985 que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase. Science 239 (1988):

43 PCR Qual é o objetivo? Quais os componentes? Mg2+ DNA Polimerase dNTP
Produzir uma quantidade apreciável de um segmento específico de DNA a partir de uma quantidade mínima Quais os componentes? Mg2+ DNA Polimerase dNTP Primers

44 Termociclador Como na técnica de PCR se encontram vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento

45 Uma reação típica de PCR
Sterile Water ul 10X PCR Buffer ul MgCl2 (50mM) ul dNTP’s (10mM each) ul PrimerFWD (25 pmol/ul) 1.0 ul PrimerREV ul DNA Polymerase ul DNA Template ul Total Volume ul

46 O que é uma molécula de DNA recombinante?
Molécula de DNA obtida através da junção de dois ou mais fragmentos de DNA 5’- -3’ 5’- -3’ 5’- -3’

47 Clonando um gene O que é clonagem?
Utilização da reprodução assexuada para obter organismos que são geneticamente iguais entre si e ao organismo parental Seleção Reprodução assexuada Isolamento

48 Clonando um gene O vetor
O DNA inserido não é replicado na célula a menos que esteja recombinado com DNA cromossômico ou inserido em replicon (elemento genético capaz de replicação autônoma) extracromossômico. Replicons são reconhecidos como substratos por enzimas da célula responsáveis pela repli- cação (ou vetores) Podem ser usados para carregar DNA recom- binante, permitindo sua replicação O tipo mais comum de vetor são os plasmídeos 20min 20min Após 30 gerações (10h) haverá 1x 109 cels

49 Clonando um gene Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado?
Endonucleases altamente específicas, conhecidas como enzimas de restrição, clivam o DNA em sítios precisamente definidos. Fragmentos são gerados por cortes nos sítios de restrição no fragmento de DNA e no vetor DNA ligases podem unir os fragmentos acima para obter a molécula de DNA recombinante Genes estão presentes em regiões contínuas de DNA cromossômico e não aparecem perfeitamente delimitados por sítios de restrição. Como conseguir o fragmento específico contendo o gene de interesse?

50 Clonando um gene Como se obtém o fragmento de DNA a ser clonado?
Há basicamente 3 possibilidades: DNA sintético PCR (RT-PCR) Triagem de Bibliotecas genômicas ou de cDNA Fragmentação mecânica Ou enzimática

51 Vetores Plasmídeos Sítio de clonagem múltipla (MCS)
Marcadores de seleção Alfa-Complementação (hospedeiro Lac-)

52 Tecnologia do DNA recombinante

53 Gene produtor de toxina