A apresentação está carregando. Por favor, espere

A apresentação está carregando. Por favor, espere

Cromatografia Liquida - CLAE UNISUL ANÁLISE INSTRUMENTAL Profa. Denise Esteves Moritz.

Apresentações semelhantes


Apresentação em tema: "Cromatografia Liquida - CLAE UNISUL ANÁLISE INSTRUMENTAL Profa. Denise Esteves Moritz."— Transcrição da apresentação:

1 Cromatografia Liquida - CLAE UNISUL ANÁLISE INSTRUMENTAL Profa. Denise Esteves Moritz

2 O que é Cromatografia ? Definição: A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra estacionária. A natureza química e física dos componentes da mistura definem o grau de afinidade entre as duas fases, acontecendo o fenômeno de migração diferencial. 2

3 O que é Cromatografia a Líquido HPLC? Definição: Na técnica de cromatografia a líquido a fase móvel é um líquido e a fase estacionária é um sólido. O processo cromatográfico acontece na fase líquida, sendo que os componentes da amostras devem estar dissolvidos. 3

4 Instrumentação para HPLC 4

5 CLAE -HPLC Fase móvel (amostra) Fase estacionária (Componentes retidos) Migrações diferenciais Analito mov Analito est K = Analito est / Analito mov = coeficiente de partição 5

6 6

7 INSTRUMENTAÇÃO pump injector column oven detector One pump used to control 4 reservoirs; mixing is done before pump. MIXER data processor Fase móvel 7

8 Instrumentação para HPLC PURGA INJETOR COLUNA FM BOMBA DETECTOR 8

9 Componentes de um Cromatógrafo a Líquido HPLC Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes principais : Injetor : É o dispositivo que tem a função de introduzir a amostra na fase móvel ; Coluna cromatografia : É o dispositivo que tem a função de separar os componentes da amostra ; Detector : É o dispositivo que tem a função de detectar os componentes eluídos da coluna cromatográficas 9

10 Componentes auxiliares de um HPLC Bomba : É o dispositivo que bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente ); É composta de um ou mais pistão acoplados a um sistema de válvulas. Fornece uma alta pressão. 10

11 BOMBA - Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min) - Opções: Simples, gradiente binário, quaternário - Mede a pressão sobre o sistema - Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.) 11

12 12

13 Componentes auxiliares de um HPLC Válvula de purga: É o dispositivo que permite a troca rápida de solvente desviando o fluxo de solvente para o dreno. Misturador: É o dispositivo que homogeneíza a mistura de solventes quando operando com gradiente de eluição. 13

14 Fase estacionária 14

15 Colunas Cromatográficas Fases estacionárias : Sílica- C8 Sílica- C18 Sílica- C18 ( ODS) Sílica- NH2 Sílica- Diol Sílica Troca Iônica Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca Resinas DVB-ST porosas Pré-Coluna: É o uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica. Tem como objetivo reter sólidos e em muitos casos reter materiais que por reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária. 15

16 SÍLICA (suporte + usado): - Resistência mecânica - Variedade de forma, tamanho de partículas e poros - Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou básicas - Superfície não homogênea COLUNAS CROMATOGRÁFICAS 16

17 SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS LIVRESGEMINALVICINAIS influenciam no grau de acidez da sílica 17

18 Fase Estacionária A fase estacionária mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica. São permeáveis ao solvente e possuem uma área superficial de varias centenas de metros por gramas. Não deve ser utilizada em sistemas com pH acima de 8,0. 18

19 MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL - QUIMICAMENTE LIGADAS - HÍBRIDAS - RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS 19

20 Fases Quimicamente Ligadas C18 (ODS) forte C8 amostra C4 média fraca 20

21 POLIMÉRICAS Pré-hidrólise do agente silanizante - Rede tridimensional mais espessa - Maior estabilidade - Dificuldade de controlar reações entrecruzamento 21

22 FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS Matriz orgânica-inorgânica - Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais - Menor quantidade de grupos de silanóis - Ultra-fast cromatografia Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano (RO) 4 Si + n(RO) 3 SiR + (1,5n+2)H 2 O SiO 2 (R SiO 1,5 ) 0,5 + (3n+4)ROH 22

23 RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS -RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ INORGÂNICA - SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS POLÍMEROS ORGÂNICOS 23

24 - Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte - Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte) Poli(etileno) Poli(butadieno) Poli(estireno) Poli(dimetilsiloxano) Poli(metiloctilsiloxano) Poli(metiloctadecilsiloxano) Poliéteres Polissacarídeos Poliaminas Polinucleotídeos Poliamidas Proteínas Sílica Zircônia Titânia Alumina 24

25 PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO) INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA 25

26 Fases estacionárias Interações C8 PH C2 van der Waals Si 26

27 Fases estacionárias Interações CN NH2 2OH Dipolo/Dipolo O H Si N H H O O H OO H H N O H C Ligação de hidrogênio Fase Estacionária 27

28 PRS CBA SAX Eletrostática H 3 + N SO 3 - Si H 3 + N O - O N + (CH 3 ) 3 Si - O 3 S Fases estacionárias Interações Fase Estacionária 28

29 Processo de Eluição Definição: Pode ser descrita como deslocamento do soluto na fase estacionária. Série eluotrópica Ordena os solventes de acordo com suas habilidades relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente. 29

30 Força eluente: É uma medida da energia de adsorção do solvente Cromatografia com fase normal: Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente menos polar. Cromatografia com fase reversa: Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente polar e um solvente polar. 30

31 DETECTORES - Classificação UNIVERSAIS : Geram sinal para qualquer substância eluída. SELETIVOS : Detectam apenas substâncias com determinada propriedade físico-química. Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluída de um analito 31

32 DETECTORES UV FLUORESCÊNCIA MS ELETROQUÍMICO IR POLARÍMETRO 32

33 É mais comum, usado na CLAE. Porque muitos solutos absorvem a luz ultravioleta. São bons para a eluição por gradiente com solventes não-absorventes. Detectores Ultra violeta: 33

34 Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela amostra, quando nela passa radiação eletromagnética. - Seletivo (moléculas com cromóforos) - Comprimento de onda (λ) fixo - λ pode ser selecionado (190 – 600 nm) - Varredura (DAD) - Solventes também absorvem Ultra violeta (UV-visível): Água MeOH ACN Acetona Hexano Clorofórmio THF λ nm Solvente 34

35 Princípio: Emissão de energia fluorescente de um soluto que foi excitado por radiação UV - Seletivo (moléculas que fluorescem) - Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas - Mais sensível que UV por ser emissão - Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para que o analito se torne fluorescente. - Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de dansila Fluorescência: 35

36 36

37 Detectores por Índice de Refração: 37

38 Princípio: Mede a diferença no índice de refração da fase móvel e do eluente vindo da coluna - Não- seletivo - Sensível a variações de: - Temperatura - Pressão - Fluxo - Composição fase móvel - Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar - Muito usado em cromatografia preparativa Indice de refração: 38

39 Princípio: Determinação da massa de solutos através da ionização e determinação da relação massa-carga (m/z) - Destrutivo 1. uma amostra é carregado no instrumento do MS, e sofre vaporização. 2. os componentes da amostra são ionizados por um de uma variedade de métodos (por exemplo, impactando-as com um feixe de elétrons), que resulta na formação de partículas carregadas (íons) 3. os íons positivos são então acelerados por um campo elétrico 4. cálculo da relação massa-carga (m / z) das partículas com base nos detalhes do movimento dos íons em que o trânsito através de campos electromagnéticos e Espectrometria de massas: 39

40 5. detecção dos íons, que na etapa 4 foram classificados de acordo com m / z. - Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS) - Interfaces de ionização mais comuns: ESI (ionização por electrospray), ApCI (ionização química à pressão atmosférica). - Análise de micro e macromoléculas. - Alta sensibilidade Espectrometria de massas: Fonte: %20%20espectrometria%20de%20massa%20.html 40

41 41

42 MODOS DE SEPARAÇÃO NORMAL REVERSO TROCA IÔNICA 42

43 MODO NORMAL MECANISMO DE INTERAÇÃO: ADSORÇÃO Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel Fase móvel: mistura de solventes orgânicos Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino 43

44 MODO REVERSO INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA HIDROFOBICIDADE Fase estacionária: APOLAR Fase móvel: H 2 O, MeOH, CH 3 CN ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO 44

45 Tempo de Retenção e Hidrofobicidade OH C18 (ODS) forte Interação fraca 45

46 Hidrofobicidade Se a amostra possui CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica : grupo aromático Se a amostra possui -COOH : grupo carboxílico -NH2 : grupo amino -OH : grupo hidróxi A hidrofobicidade será forte A hidrofobicidade será fraca 46

47 TROCA IÔNICA MECANISMO DE INTERAÇÃO : ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas) Fase móvel: Tampão (pH,, força iônica, temperatura) Aniônicas: amônio quaternário, aminas Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico 47

48 Microsseringas para Injeção LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L êmbolo corpo (pirex) agulha (inox 316) Obs: Seringa de HPLC 48

49 Seqüência Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos Condicionamento da coluna com fase móvel Monitoramento da linha de base Injeção das amostras 49

50 PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS FATOR DE RETENÇÃO (k) FATOR DE SEPARAÇÃO ( ) NÚMERO DE PRATOS (N) 50

51 Cromatograma tRtR tMtM TEMPO SINAL t R = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico) t M (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um composto que não interaja com a FE atravesse a coluna) 51

52 A migração de um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda: TEMPO Efeitos do alargamento excessivo de picos: EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito. 52

53 w 2 na linha de base BANDA CROMATOGRÁFICA 53

54 Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases Não leva em conta o tempo morto da coluna FATOR DE RETENÇÃO (k) t r – t o k = toto t r = tempo retenção analito t o = tempo morto da coluna 54

55 Se: t 0 = 1,5 min t 1 = 3,5 min t 2 = 4,2 min k 1 = 1,3 k 2 = 1,8 55

56 FATOR DE SEPARAÇÃO ( ) k2k2 = k1k1 AVALIA A SELETIVIDADE 56

57 Se: k 1 = 1,3 k 2 = 1,8 = 1,38 k1 = 1,3 k2 = 1,8 k2k2 = k1k1 = 1 não houve separação 57

58 NÚMERO DE PRATOS (N) Mede a eficiência do sistema Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel trtr N= 5,54 w 0,5 2 58

59 Resolução é função da Seletividade ( ) Eficiência da coluna (N) Fator de retenção (k) 59

60 Resolução Rs = 0.8 Rs = 1.25 Rs =

61 61

62 FASE MÓVEL - Solvente grau HPLC (alta pureza) - Filtração (membrana 0.45 μm) - Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento de He ou automático) - Purgar os solventes 62

63 MODOS DE ELUIÇÃO ISOCRÁTICO: Uma única composição de fase móvel ao longo da corrida; a composição ds FM é CONSTANTE. GRADIENTE: - Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo da corrida. - Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20) 63

64 Mudança no modificador orgânico a b c d a b c d [ MeOH/H 2 O ] par crítico : c,d [ THF/H 2 O ] par crítico : a,b a b c d [ MeOH/THF/H 2 O ] 64

65 1)COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..) 2)ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE) 3)EXTRAÇÃO: - LÍQUIDO-LÍQUIDO - LÍQUIDO-SÓLIDO - SOXHLET - FLUÍDO SUPER CRÍTICO - EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE) PREPARAÇÃO DA AMOSTRA 65

66 Filtração É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas de 0.45 m mesh para a remoção do material insolúvel. 66

67 DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante AMOSTRA PADRÃO Comparação de cromatogramas da amostra e de uma solução padrão do analito suspeito 67

68 ANÁLISE QUANTITATIVA A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector Cálculo de área: 68

69 ANÁLISE QUANTITATIVA Se ambos os compostos respondessem igualmente ao detector poderíamos usar a relação: Massa A Área A Massa B Área B No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá áreas diferentes, em função da resposta ao detector. 69

70 PADRONIZAÇÃO EXTERNA Este método baseia-se na comparação de uma certa substância presente na amostra com seu respectivo padrão. Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x concentração) da substância padrão: 70

71 PADRONIZAÇÃO EXTERNA Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração dessa substância na amostra. É importante salientar que o gráfico deve ser construído com concentrações próximas da concentração esperada na amostra. Outro fator muito importante é que o volume injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume injetado de amostra. Por esta razão este tipo de padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume injetado. Neste método não são usados fatores de correção para corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância 71

72 PADRONIZAÇÃO INTERNA Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada componente que se deseja determinar com a área corrigida do padrão adicionado, do qual se conhece a concentração. Mx = massa do componente x Ma = massa da amostra Mp = massa do padrão Ap = área do padrão Ax = área corrigida do componente x 72

73 PADRONIZAÇÃO INTERNA A escolha do padrão deve ser feita, sempre que possível, entre compostos semelhantes aos que existem na amostra, não devendo coincidir com nenhum composto da mesma, e estar próximo ou entre os picos da amostra. Deve ser também uma substância pura para que apresente apenas um pico no cromatograma, e para que esse pico possa ser relacionado à massa pesada Este método possibilita a determinação de apenas um dos componentes de uma mistura, sem haver necessidade de conhecer os outros componentes. 73

74 APLICAÇÕES 74

75 APLICAÇÕES cont… 75

76 APLICAÇÕES cont… 76

77 TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel; VILEGAS, Wagner and ZANONI, Maria Valnice Boldrin. Determinação de corantes marcadores do tipo azo e antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp ISSN AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins Ribeiro6 77


Carregar ppt "Cromatografia Liquida - CLAE UNISUL ANÁLISE INSTRUMENTAL Profa. Denise Esteves Moritz."

Apresentações semelhantes


Anúncios Google