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Cromatografia–Noções gerais e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: Vitória Berg Cattani Universidade Federal de Santa Maria Centro de Educação Superior.

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1 Cromatografia–Noções gerais e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: Vitória Berg Cattani Universidade Federal de Santa Maria Centro de Educação Superior Norte - RS

2 CROMATOGRAFIA Michael Tswett éter de petróleo CaCO 3 mistura de pigmentos separados

3 CROMATOGRAFIA Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). Princípio Básico

4 TIPOS DE MECANISMOS Depende do tipo de fase estacionária. Transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária. ADSORÇÃO Na superfície das partículas sólidas. PARTIÇÃO Entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionária que fica nos poros de um suporte sólido inerte. BIOAFINIDADE

5 TIPOS DE MECANISMOS TROCA IÔNICA Com componentes iônicos da fase estacionária; Inclui resinas trocadoras de cátions e de ânions. EXCLUSÃO Processo mecânico

6 CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA PlanarEm coluna GasosaFluido supercrítico Líquida Líquido Centrífuga (chromatotrom) CCD CPCP CGClássica CGAR CLAE ou HPLC Técnica Fase Móve l

7 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR padrõesamostras

8 CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR Aplicações: separação de substâncias; identificação de substâncias. Rf = ds/dm dm ds 1 ds 2

9 CHROMATOTRON ® Aplicações: separação de substâncias. CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR Eluente

10 CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA Aplicações: separação de substâncias. CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA Solvente Fase estacionária Algodão

11 CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA

12 CROMATOGRAFIA GASOSA CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA Usada para separar compostos orgânicos voláteis; Separação ocorre devido a partição entre: fase móvel (gás inerte); fase estacionária (sílica da coluna). Aplicações: Separação de substâncias; Identificação de substâncias: tempo de retenção; espectro de massas (CG-MS); Quantificação de substâncias (padrão).

13 AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA CROMATOGRAFIA GASOSA CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA

14 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) OU HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA

15 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA COLUNA CROMATOGRÁFICA

16 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA COLUNA CROMATOGRÁFICA Solvente (fase móvel)

17 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA FASE ESTACIONÁRIA FASE NORMAL Superfície da sílica com característica POLAR. FASE REVERSA Superfície da sílica com revestimento APOLAR. Ex.: C18 (ODS), C8 – fase ligada; Ex.: poliestireno, poliacrilato – polímeros adsorvidos.

18 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA FASE ESTACIONÁRIA

19 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte

20 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bomba

21 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bomba injetor detector

22 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bomba injetor detector mistura degasser

23 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bomba injetor detector mistura degasser ELUIÇÃO ISOCRTÁTICA OU ELUIÇÃO EM GRADIENTE

24 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bomba injetor detector Degas- ser

25 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bombainjetor detector Degas- ser

26 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bombainjetor detector Degas- ser

27 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bombainjetor detector Degas- ser

28 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bombainjetor detector Degas- ser

29 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte bombainjetor detector Degas- ser

30 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA DETECTORES: UV/vis – baseado na absorção de luz pelo analito. Boa sensibilidade (0,01-100µg) DAD (diode array detector) – tipo avançado de UV Fluorescência Eletroquímico Massa

31 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA APLICAÇÕES: Separação de substâncias; Identificação de substâncias: tempo de retenção; espectro de absorção no UV-VIS( HPLC-UV/VIS); Quantificação de substâncias (padrão).

32 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA VANTAGENS: Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores; Seletividade; Menor risco de degradação da amostra (CG); Boa sensibilidade (nanogramas).

33 HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA LIMITAÇÕES: Alto custo do equipamento; Alto custo da operação (colunas e solventes); Experiência do analista no manuseio do equipamento; Necessidade de extração antes do uso; Grande quantidade de resíduo formado.

34 CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS Retenção ou Fator de Capacidade (k) Mede o tempo de permanência do composto na fase estacionária comparado com o tempo de permanência na fase móvel durante a corrida. Indica o grau de afinidade que a fase estacionária e a fase móvel possuem pelo composto. T 0 : tempo de retenção de um composto não retido pela coluna Seletividade ( ) Compara a retenção de um componente com a retenção de outro componente, indicando até que ponto o sistema químico (coluna e fase móvel) os diferencia.

35 CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS Resolução (R) Avalia a qualidade da separação entre dois componentes de acordo com uma determinada condição cromatográfica. Eficiência (N) Indica o quanto o sistema de CLAE permite que a banda de um componente se dilua durante a corrida cromatográfica. Avalia o alargamento da banda de um pico de um componente causados por fatores ligados ao injetor, coluna, fase móvel, detector.

36 CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS Influência da geometria da coluna na separação cromatográficaInfluência da geometria da coluna na separação cromatográfica Comprimento (maior) Maior eficiência (n o de pratos teóricos); Maior tempo de análise e consumo de solventes; Maior resolução; Maior capacidade; Maior pressão de trabalho. Diâmetro interno (menor) Maior seletividade (picos mais finos); Maior eficiência (menor diluição do pico); Menor capacidade; Análise mais rápida, menor consumo de solventes e menor pressão.

37 SPE NH 2 SPE C 18 Benomyl Tebuthiuron Simazine Atrazine Diuroion Ametryn Coluna C18, FM: ACN:0,01% NH 4 OH (35:65, v/v), fluxo 0,7 mL/min.

38 Triazine Simazine Atrazine FM: ACN:H2O: CH3COOH (50:50:0,01, v/v) Coluna C18; fluxo: 0,3 mL/mi); detecção: 220nm

39 Folpet Chlorothalonil Quinomethionat Tetradifon Trifluralin FM (gradiente côncavo): ACN:H2O (40:60 a 90:10 em 20 min; permaneceu 90:10 por 5 min; retornou a 40:60 em 5 min). Coluna C18; fluxo: 1,0 mL/min; detecção: 220 e 260 nm


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