Universidade Federal de Santa Maria Centro de Educação Superior Norte - RS Cromatografia–Noções gerais e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: EXEMPLOS.

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Universidade Federal de Santa Maria Centro de Educação Superior Norte - RS
Cromatografia–Noções gerais e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência: EXEMPLOS PRÁTICOS; ARTIGOS; CG Vitória Berg Cattani

CROMATOGRAFIA Michael Tswett - 1906 éter de petróleo mistura de
CaCO3 mistura de pigmentos pigmentos separados Kroma = cor Graph = escrever Escrevendo em cores

CROMATOGRAFIA Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). TRATA-SE DE UM MÉTODO FÍSICO-QUÍMICO DE SEPARAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS, POR MIGRAÇAO DIFERENCIAL (INTERAÇÃO) ENTRE DUAS FASES IMISCÍVEIS: FASE MÓVEL E A FASE ESTACIONÁRIA.

TIPOS DE MECANISMOS Depende do tipo de fase estacionária.
Transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária. ADSORÇÃO Na superfície das partículas sólidas. PARTIÇÃO Entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionária que fica nos poros de um suporte sólido inerte. BIOAFINIDADE

TIPOS DE MECANISMOS TROCA IÔNICA
Com componentes iônicos da fase estacionária; Inclui resinas trocadoras de cátions e de ânions. EXCLUSÃO Processo mecânico

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA
Técnica Planar Em coluna Fase Móvel Planar: CCD e papel Coluna: cromatografia clássica e CLAE Polaridade relativa das fases fase normal fase reversa 5. Mecanismo de separação Processos físicos adsorção absorção Processos químicos troca iônica bioafinidade fase quimica/ligada Processos mecânicos exclusão Líquido Gasosa Fluido supercrítico Líquida Centrífuga (chromatotrom) CCD CP CG CGAR Clássica CLAE ou HPLC

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 1. PLANAR
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA padrões amostras

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA Aplicações: separação de substâncias; identificação de substâncias. dm Rf = ds/dm ds2 ds1

CHROMATOTRON® Eluente Aplicações: separação de substâncias.

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA: 2. EM COLUNA
CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA Aplicações: separação de substâncias. Solvente Fase estacionária Algodão

CROMATOGRAFIA EM COLUNA CLÁSSICA

CLASSIFICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA 2. EM COLUNA
CROMATOGRAFIA GASOSA Usada para separar compostos orgânicos voláteis; Separação ocorre devido a partição entre: fase móvel (gás inerte); fase estacionária (sílica da coluna). Aplicações: Separação de substâncias; Identificação de substâncias: tempo de retenção; espectro de massas (CG-MS); Quantificação de substâncias (padrão).

CROMATOGRAFIA GASOSA caracterização de óleos voláteis quantificação de fármacos e seus metabólitos em fluidos biológicos AUMENTO DA TEMPERATURA DA COLUNA

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) OU HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores  seletividade; Menor risco de degradação da amostra (CG); Facilmente automatizado; Boa sensibilidade (nanogramas). Determinação do coeficiente de partição e de valores de pka de fármacos; Alto custo do equipamento; Alto custo da operação (colunas e solventes); Experiência do analista no manuseio do equipamento; Necessidade de extração antes do uso; Grande quantidade de resíduo formado.

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) COLUNA CROMATOGRÁFICA

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) COLUNA CROMATOGRÁFICA Solvente (fase móvel)

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) FASE ESTACIONÁRIA FASE NORMAL Superfície da sílica com característica POLAR. FASE REVERSA Superfície da sílica com revestimento APOLAR. Ex.: C18 (ODS), C8 – fase ligada; Ex.: poliestireno, poliacrilato – polímeros adsorvidos.

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) FASE ESTACIONÁRIA

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ESTRUTURA DO HPLC fase móvel descarte

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ESTRUTURA DO HPLC bomba fase móvel descarte

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ESTRUTURA DO HPLC bomba injetor fase móvel detector descarte

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ESTRUTURA DO HPLC bomba injetor fase móvel mistura degasser detector descarte

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ESTRUTURA DO HPLC bomba injetor fase móvel mistura degasser detector ELUIÇÃO ISOCRTÁTICA OU ELUIÇÃO EM GRADIENTE descarte

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) ESTRUTURA DO HPLC bomba injetor fase móvel Degas-ser detector descarte

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) DETECTORES: UV/vis – baseado na absorção de luz pelo analito. Boa sensibilidade (0,01-100µg) DAD (diode array detector) – tipo avançado de UV Fluorescência Eletroquímico Massa Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores  seletividade; Menor risco de degradação da amostra (CG); Facilmente automatizado; Boa sensibilidade (nanogramas). Alto custo do equipamento; Alto custo da operação (colunas e solventes); Experiência do analista no manuseio do equipamento; Necessidade de extração antes do uso; Grande quantidade de resíduo formado.

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) APLICAÇÕES: Separação de substâncias; Identificação de substâncias: tempo de retenção; espectro de absorção no UV-VIS( HPLC-UV/VIS); Quantificação de substâncias (padrão). Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores  seletividade; Menor risco de degradação da amostra (CG); Facilmente automatizado; Boa sensibilidade (nanogramas). Alto custo do equipamento; Alto custo da operação (colunas e solventes); Experiência do analista no manuseio do equipamento; Necessidade de extração antes do uso; Grande quantidade de resíduo formado.

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) VANTAGENS: Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores; Seletividade; Menor risco de degradação da amostra (CG); Boa sensibilidade (nanogramas). Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores  seletividade; Menor risco de degradação da amostra (CG); Facilmente automatizado; Boa sensibilidade (nanogramas). Alto custo do equipamento; Alto custo da operação (colunas e solventes); Experiência do analista no manuseio do equipamento; Necessidade de extração antes do uso; Grande quantidade de resíduo formado.

HIGHT PERFORMED LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) LIMITAÇÕES: Alto custo do equipamento; Alto custo da operação (colunas e solventes); Experiência do analista no manuseio do equipamento; Necessidade de extração antes do uso; Grande quantidade de resíduo formado. Versatilidade (compostos orgânicos, inorgânicos, sólidos, líquidos) e variedade de colunas e detectores  seletividade; Menor risco de degradação da amostra (CG); Facilmente automatizado; Boa sensibilidade (nanogramas). Alto custo do equipamento; Alto custo da operação (colunas e solventes); Experiência do analista no manuseio do equipamento; Necessidade de extração antes do uso; Grande quantidade de resíduo formado.

CLAE – PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
Retenção ou Fator de Capacidade (k’) Mede o tempo de permanência do composto na fase estacionária comparado com o tempo de permanência na fase móvel durante a corrida. Indica o grau de afinidade que a fase estacionária e a fase móvel possuem pelo composto. T0: tempo de retenção de um composto não retido pela coluna Seletividade (a) Compara a retenção de um componente com a retenção de outro componente, indicando até que ponto o sistema químico (coluna e fase móvel) os diferencia.

Resolução (R) Avalia a qualidade da separação entre dois componentes de acordo com uma determinada condição cromatográfica. Eficiência (N) Indica o quanto o sistema de CLAE permite que a banda de um componente se dilua durante a corrida cromatográfica. Avalia o alargamento da banda de um pico de um componente causados por fatores ligados ao injetor, coluna, fase móvel, detector. Fatores q influenciam N: diferença de comprimento de percurso Transferencia de massa entre fases estacionária e móvel.

Influência da geometria da coluna na separação cromatográfica Comprimento (maior) Maior eficiência (no de pratos teóricos); Maior tempo de análise e consumo de solventes; Maior resolução; Maior capacidade; Maior pressão de trabalho. Diâmetro interno (menor) Maior seletividade (picos mais finos); Maior eficiência (menor diluição do pico); Menor capacidade; Análise mais rápida, menor consumo de solventes e menor pressão.

Coluna C18, FM: ACN:0,01% NH4OH (35:65, v/v), fluxo 0,7 mL/min.
Benomyl Tebuthiuron Simazine Atrazine Diuroion Ametryn SPE C18 SPE NH2 Coluna C18, FM: ACN:0,01% NH4OH (35:65, v/v), fluxo 0,7 mL/min.

Triazine Simazine Atrazine FM: ACN:H2O: CH3COOH (50:50:0,01, v/v) Coluna C18; fluxo: 0,3 mL/mi); detecção: 220nm

Folpet Chlorothalonil Quinomethionat Tetradifon Trifluralin FM (gradiente côncavo): ACN:H2O (40:60 a 90:10 em 20 min; permaneceu 90:10 por 5 min; retornou a 40:60 em 5 min). Coluna C18; fluxo: 1,0 mL/min; detecção: 220 e 260 nm

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