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1 Cardosina A Estrutura terciária. 2 Precursor Intermediário Cardosina A madura Modelo proposto para o processamento proteolítico da Cardosina A. Os locais.

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1 1 Cardosina A Estrutura terciária

2 2 Precursor Intermediário Cardosina A madura Modelo proposto para o processamento proteolítico da Cardosina A. Os locais de clivagem Pro/cadeia de 31 KDa, cadeia de 31 KDa/PSI e PSI/cadeia de 15 KDa estão assinalados com setas. Pro31 KDa15 KDaPSI RGTVRDSGSA HAIGANGVMNQQ EHLSTSSEE

3 3 Cardosina A Estrutura secundária Cadeia de 15 KDa Cadeia de 31 KDa

4 4 Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. Tampão citrato de sódio 100 mM, pH 3,5 1 Passo. Extracção Acídica

5 5 Separação baseada em propriedades dos compostos Exclusão Molecular Detector UV MBarros Direcção do fluxo Solvente Proteínas fraccionadas

6 6 2 Passo. Cromatografia de Exclusão Molecular Coluna: Superdex G75 Eluente: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L.

7 7 MBarros Separação baseada em propriedades dos compostos Detector UV Cromatografia de Troca Iónica TampãoB TampãoA Bombas A e B Aplicação da amostra Mistura de proteína s Proteínas carregadas + são eluídas primeiro Coluna de DEAE Resina Proteína + Proteína - Gradiente linear de sal Força iónica Mistura de proteína s

8 8 Coluna: Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE) Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Gradiente crescente de 1M NaCl Gradiente crescente de 1M NaCl Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. 3 Passo. Cromatografia de troca iónica

9 9 31 KDa 15 KDa 34 KDa 14 KDa A0A0 5. Controlo de Pureza das Cardosinas Para o controlo de pureza das amostras de cardosinas recorre-se a electroforese vertical em gel de poliacrilamida, em condições desnaturantes (SDS-PAGE). Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. Após Q Sepharose (trocador aniónico forte DEAE)

10 10 As amostras de cardosinas A 0, A e B recolhidas na cromatografia de troca iónica são sujeitas a uma nova cromatografia de exclusão molecular numa coluna Desalting G25, com o objectivo de remover o sal. 4 Passo. Desalting – eliminar o sal das amostras da cromatografia anterior Coluna: Sephadex G25 Eluente: Água Mili_Q (água ultra pura) Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L.

11 11 Coluna: Mono Q (trocador aniónico) Eluentes: Tampão Tris 25 mM, pH 7,6 Gradiente crescente de 1 M NaCl Extracção e purificação de cardosinas a partir dos pistilos de Cynara cardunculus L. A amostra de cardosina B necessita de ser submetida a uma nova cromatografia de troca iónica numa coluna de maior resolução, a fim de remover a maior parte da cardosina A que contamina a amostra obtida na primeira troca iónica. 6 Passo. Recromatografia de troca iónica da amostra de cardosina B

12 12 Resumo A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou afinidade por determinados ligandos A cromatografia liquida separa as proteínas, ácidos nucleicos e outras moléculas de acordo com a sua massa, carga ou afinidade por determinados ligandos Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma superfície sólida. Baseia-se no princípio de que moléculas dissolvidas numa solução podem interagir (ligar e dissociar-se) com uma superfície sólida. A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém um gel constituído por esferas. A cromatografia líquida é realizada numa coluna que contém um gel constituído por esferas. A natureza das esferas determina o tipo de separação realizado. De acordo com: A natureza das esferas determina o tipo de separação realizado. De acordo com: - a massa, cromatografia de exclusão molecular- a massa, cromatografia de exclusão molecular - a carga, cromatografia de troca iónica- a carga, cromatografia de troca iónica - a afinidade, cromatografia de afinidade- a afinidade, cromatografia de afinidade MBarros


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