Técnicas de Eletroforese

Apresentação em tema: "Técnicas de Eletroforese"— Transcrição da apresentação:

1 Técnicas de Eletroforese
Rodrigo Rocha Latado

2 Eletroforese Diversos métodos para análise de:
Ácidos nucléicos (DNA e RNA) Proteínas Enzimas

3 ETAPAS Preparar a amostra (DNA total, Produtos de PCR, Proteínas, etc...) Preparar o gel Aplicar as amostras no gel Eletroforese Coloração do gel, Fixação, Documentação

4 - carga elétrica e tamanho da molécula (partícula)
CLASSIFICAÇÃO Tipos: - agarose - poliacrilamida desnaturante não desnaturante - amido (para isoenzimas) Princípios: - carga elétrica e tamanho da molécula (partícula) - pH (focalização isoelétrica)

5 Detecção: Visualização:
brometo de etídeo, SYBR, nitrato de prata, fluorescência substratos específicos (isoenzimas) Visualização: UV, direta, câmera

6 Eletroforese Sharp, Sambrook and Sugden

7 Eletroforese Syber green
Singer VL, Lawlor TE, Yue S Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat. Res. 439(1):37-47. Syber green

8 Àcidos Nucléicos Ácido nucléico exposto a campo elétrico migra para eletrodo na velocidade ou mobilidade proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula mobilidade: inversamente proporcional ao coeficiente friccional coeficiente friccional: função do tamanho e forma da molécula e viscosidade do meio

9 Eletroforese Moléculas separadas por:
tamanho forma ou conformação magnitude de cargas Sob pH fisiológico -> fosfatos ionizados poliânions correm em direção ao eletrodo positivo Eletroforese pólo negativo -> pólo positivo

10 Eletroforese

11 Eletroforese Tamanho da Molécula de DNA
DNA linear migra inversa/ proporcional ao log10 do seu peso molecular

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13 Eletroforese AGAROSE:
polissacarídeo linear de galactose com unidades de b-D-galactopiranose com ligações 1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose PM médio: Da

14 Agarose

15 Eletroforese em gel de agarose
- Tampão (TAE ou TBE) e agarose - Concentração agarose varia entre 1 e 3% - Fundir a agarose no tampão e aplicar na fôrma - Esperar esfriar, retirar o pente - Aplicar as amostras no gel - Iniciar a eletroforese

16 Eletroforese Tampões: água eletrolisada gerando H+
no anodo e OH- no catodo terminal catódico (+) -> básica terminal anódico (-) -> ácida requer tampão para evitar gradientes de pH

17 Eletroforese

18 Eletroforese TAE TBE para recuperação de fragmentos
preferido moléculas maiores menor campo de força maior porosidade TBE preferido para moléculas menores < 1Kb interage com agarose - poros menores

19 Eletroforese Voltagem expressar sempre em V cm-1
gradiente de voltagem - distância entre eletrodos voltagem excessiva - rastro de banda voltagem baixa - difusão de bandas pequenas <1 Kb TBE - bandas pequenas mais finas TAE - bandas maiores

20 Eletroforese

21 Eletroforese Tempo de corrida
correr gel até banda de interesse ter migrado de 40 a 60% do comprimento do gel parte inferior do gel - difusão e dispersão

22 Eletroforese Tampão de Carregamento: Concentração 6 a 10x
aumentar densidade da amostra - depositar amostra no fundo do poço adicionar cor a amostra adicionar corantes de mobilidade ou migração azul de bromofenol xileno cianol verde de bromocresol

23 Eletroforese- Poliacrilamida

24 GEL DE POLIACRILAMIDA - Géis de Poliacrilamida são obtidos a partir da formação de ligações entre o polímero acrilamida e o co-monômero bis-acrilamida. - Essa reação covalente é geralmente catalizada por persulfato de amônio e iniciada por TEMED, uma amina terciária. - Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida através de variações de: Concentração de acrilamida e bis-acrilamida Grau de polimerização

25 GEL DE POLIACRILAMIDA - A matriz de poliacrilamida por possuir poros menores do que a matriz de agarose, géis de acrilamida são usados para separar fragmentos de DNA menores que 2 kpb, enquanto que moléculas de até 200 kpb podem ser separaradas em géis de agarose. - De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp, enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1 a 0,05 Kpb.

26 Eletroforese

27 ACRILAMIDA DESNTAURANTE
- Acréscimo de Uréia no gel para a manutenção do DNA na forma de fita simples - Amostras de DNA são desnaturadas a o C, na presença de Formamida, antes da eletroforese