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Técnicas de Eletroforese Rodrigo Rocha Latado. Eletroforese Diversos métodos para análise de: Ácidos nucléicos (DNA e RNA) Proteínas Enzimas.

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1 Técnicas de Eletroforese Rodrigo Rocha Latado

2 Eletroforese Diversos métodos para análise de: Ácidos nucléicos (DNA e RNA) Proteínas Enzimas

3 ETAPAS Preparar a amostra ( DNA total, Produtos de PCR, Proteínas, etc...) Preparar o gel Aplicar as amostras no gel Eletroforese Coloração do gel, Fixação, Documentação

4 CLASSIFICAÇÃO Tipos: - agarose - poliacrilamida desnaturante não desnaturante - amido (para isoenzimas) Princípios: - carga elétrica e tamanho da molécula (partícula) - pH (focalização isoelétrica)

5 Detecção: –brometo de etídeo, SYBR, nitrato de prata, fluorescência –substratos específicos (isoenzimas) Visualização: –UV, direta, câmera

6 Eletroforese Sharp, Sambrook and Sugden

7 Eletroforese Syber green Singer VL, Lawlor TE, Yue S Comparison of SYBR Green I nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity in the Salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames test). Mutat. Res. 439(1):

8 Àcidos Nucléicos Ácido nucléico exposto a campo elétrico migra para eletrodo na velocidade ou mobilidade proporcional a força do campo e a carga líquida da molécula –mobilidade: inversamente proporcional ao coeficiente friccional –coeficiente friccional: função do tamanho e forma da molécula e viscosidade do meio

9 Eletroforese Moléculas separadas por: –tamanho –forma ou conformação –magnitude de cargas Sob pH fisiológico -> fosfatos ionizados –poliânions correm em direção ao eletrodo positivo –Eletroforese pólo negativo -> pólo positivo

10 Eletroforese

11 Tamanho da Molécula de DNA –DNA linear migra inversa/ proporcional ao log 10 do seu peso molecular

12

13 Eletroforese AGAROSE: polissacarídeo linear de galactose com unidades de -D-galactopiranose com ligações 1,3 e 3,6-anidro-a-L-galactopiranose PM médio: Da

14 Agarose

15 Eletroforese em gel de agarose - Tampão (TAE ou TBE) e agarose - Concentração agarose varia entre 1 e 3% - Fundir a agarose no tampão e aplicar na fôrma - Esperar esfriar, retirar o pente - Aplicar as amostras no gel - Iniciar a eletroforese

16 Eletroforese Tampões: água eletrolisada gerando H+ no anodo e OH- no catodo –terminal catódico (+) -> básica –terminal anódico (-) -> ácida requer tampão para evitar gradientes de pH

17 Eletroforese

18 TAE –para recuperação de fragmentos –preferido moléculas maiores –menor campo de força –maior porosidade TBE –preferido para moléculas menores < 1Kb –interage com agarose - poros menores

19 Eletroforese Voltagem –expressar sempre em V cm -1 –gradiente de voltagem - distância entre eletrodos –voltagem excessiva - rastro de banda –voltagem baixa - difusão de bandas pequenas <1 Kb –TBE - bandas pequenas mais finas –TAE - bandas maiores

20 Eletroforese

21 Tempo de corrida –correr gel até banda de interesse ter migrado de 40 a 60% do comprimento do gel –parte inferior do gel - difusão e dispersão

22 Eletroforese Tampão de Carregamento: Concentração 6 a 10x –aumentar densidade da amostra - depositar amostra no fundo do poço –adicionar cor a amostra –adicionar corantes de mobilidade ou migração azul de bromofenol xileno cianol verde de bromocresol

23 Eletroforese- Poliacrilamida

24 GEL DE POLIACRILAMIDA - Géis de Poliacrilamida são obtidos a partir da formação de ligações entre o polímero acrilamida e o co-monômero bis-acrilamida. - Essa reação covalente é geralmente catalizada por persulfato de amônio e iniciada por TEMED, uma amina terciária. - Uma ampla faixa de tamanho de poros pode ser obtida através de variações de: Concentração de acrilamida e bis-acrilamida Grau de polimerização

25 GEL DE POLIACRILAMIDA - A matriz de poliacrilamida por possuir poros menores do que a matriz de agarose, géis de acrilamida são usados para separar fragmentos de DNA menores que 2 kpb, enquanto que moléculas de até 200 kpb podem ser separaradas em géis de agarose. - De forma geral, um gel de 12 cm, a 1% de agarose separa fragmentos na faixa de 30 a 0,2 Kbp, enquanto que a 7,5% de poliacrilamida separa entre 1 a 0,05 Kpb.

26 Eletroforese

27 ACRILAMIDA DESNTAURANTE - Acréscimo de Uréia no gel para a manutenção do DNA na forma de fita simples - Amostras de DNA são desnaturadas a o C, na presença de Formamida, antes da eletroforese


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