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Ecologia Microbiana Dra. Ana Paula Ramos. Informação genética Replicação do DNA e elementos envolvidos Técnicas moleculares mais usadas ٭Isolamento de.

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1 Ecologia Microbiana Dra. Ana Paula Ramos

2 Informação genética Replicação do DNA e elementos envolvidos Técnicas moleculares mais usadas ٭Isolamento de material genético ٭Técnicas de amplificação de ácidos nucléicos -PCR e variações, PCR em tempo real *Técnicas de amplificação do sinal -Hibridizações Fase sólida Blothings (Southern, Northern, Dot Blot) Fase líquida *Técnicas para análise de seqüências -RFLP -RAPD Aplicações das técnicas Objetivos da Aula:

3 DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição Composição do DNA e do RNA - DNA: carrega a informação genética - RNA: molécula intermediária entre a informação e a expressão gênica Ácidos Nucleicos são formados por blocos de construção pareados: purinas e pirimidinas (bases nitrogenadas) fosfato e açúcar Ligações químicas

4 DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição Replicação do DNA: várias enzimas DNA Polimerase SSB (Single Strand Binding Protein) Primase Helicases DNA ligase

5 DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição –Adenina –Guanina –Citosina –Timina –Adenina –Guanina –Citosina –Uracila Purinas Pirimidinas DNA RNA Açúcar Desoxirribose Ribose Fita dupla Fita simples

6 DNA e RNA: estrutura, replicação e transcrição TranscriçãoTranscrição e Tradução (expressão gênica): dogma central É o processo pelo qual uma molécula de RNA é sintetizada a partir da informação contida na sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA de fita dupla

7 Por que métodos moleculares?? Metodologia clássica x Métodos moleculares -Dificuldade em recuperar as células de um sistema Microrganismos pouco concentrados em amostras ambientais (água...) Alto número de microrganismos viáveis, mas não cultiváveis (91 a 99%)

8 Estratégias gerais para estudar seqüências específicas de DNA População a ser estudada Amplificação específica Detecção específica Análise de seqüências Amplificação in vitro Hibridizações RFLP, RAPD e sequenciamento

9 Isolamento e purificação do material genético –Remover qualquer material ou componente celular que possa interferir nas técnicas moleculares Recuperação celular: por centrifugação Lise celular: detergentes Desproteinização: uso de enzimas Extração de ácidos nucléicos Purificação de ácidos nucléicos Métodos diferentes para amostras diferentes

10 PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) Desnaturação: 95°C Anelamento: 55°C Extensão: 72°C Desnaturação: 95°C Anelamento: 55°C Extensão: 72°C 25 a 40 ciclos Amplificação in vitro de ácidos nucléicos: aumento da possibilidade de visualizar estas moléculas –DNA molde (alvo) –Iniciadores –Nucleotídeos (dNTPs) –Íons Magnésio (necessários para ativar a enzima) –DNA polimerase –Tampão (manutenção do pH ótimo)

11 REA Ç ÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE -PCR Seqüência alvo

12 Ciclo da PCR - etapa 1 Seqüência alvo DESNATURAÇÃO DO DNA

13 Ciclo da PCR - etapa 2 Seqüência alvo Iniciador 1 Iniciador HIBRIDIZAÇÃO DOS INICIADORES NO DNA ALVO

14 Ciclo da PCR - etapa 3 Seqüência alvo Iniciador 1 Iniciador Taq DNA Polimerase SÍNTESE DA CADEIA COMPLEMENTAR PELA TAQ DNA POLIMERASE

15 Final do primeiro ciclo da PCR Seqüência alvo DUAS CÓPIAS DA SEQÜÊNCIA ALVO

16 Ciclos da PCR Desnaturação HibridaçãoExtensão Final do ciclo

17 1 ciclo = 2 Amplicons 2 ciclos = 4 Amplicons 3 ciclos = 8 Amplicons 4 ciclos = 16 Amplicons 5 ciclos = 32 Amplicons 6 ciclos = 64 Amplicons 7 ciclos = 128 Amplicons No. No. Amplicons Ciclos Copias do DNA alvo Produtos de PCR

18 Visualização dos produtos de PCR por Eletroforese Separação de moléculas por peso molecular: ácidos nucléicos ou proteínas Diferença de potencial entre dois eletrodos (+ e -) Matriz polimerizada : agarose e poliacrilamida

19 RT-PCR – Transcrição reversa Nested-PCR – Iniciadores internos, dois rounds de amplificação PCR Multiplex – Vários iniciadores ICC/PCR – PCR associada à cultura celular Variações da PCR

20 RT- PCR Não segue o dogma central da biologia molecular Trabalhar com DNA é mais estável ! Utilizado em estudos de expressão gênica Utilizado para detecção viral (vírus de RNA) RNA Transcrição Reversa cDNA

21 Nested PCR

22 Multiplex PCR

23 ICC-PCR (Integrated Cell Culture - PCR ) Amostra processada Cultura Crescimento / efeito citopático Lise celular e extração dos ác. nucléicos do lisado RT-PCR / PCR Eletroforese: produto específico Para os casos nos quais há necessidade de aumentar a concentração microbiana e há muitos inibidores: amostras ambientais Deixa-se um tempo padronizado onde não é necessário observar crescimento / ECP, mas já é possível a detecção por PCR Ajuda na remoção de inibidores o que aumenta a sensibilidade da PCR Volume de análise muito maior

24 PCR em tempo real - quantitativo

25 Diagrama de um sinalizador molecular. Este sinalizador tem 33 nucleotídeos com um corante fluorescente (R) ligado ao terminal 5´ e um bloqueador de sinais (Q) no terminal 3´. As 9 bases do terminal 5´pareiam com as 9 bases do terminal 3´ e faz com que o sinal fluorescente fique muito próximo ao bloqueador. Quando o fluorescente é excitado ele é bloqueado pelo bloqueador e nenhuma fluorescência é detectada. As bases em rosa representam sequências que pareiam especificamente com o produto de PCR.

26 Detecção do produto do PCR pelo sinalizador molecular. Quando o sinalizador liga-se ao produto de PCR (T°C de 5 a 10°C mais elevada que a T°C de anelamento dos primers), ele vai fluorescer quando excitado no comprimento de onda adequado. A quantidade de fluorescência é diretamente proporcional à quantidade de produto de PCR amplificada.

27 MÉTODO TAQMAN Sonda TaqMan® complementar a uma região interna do produto de PCR e ligada a um composto fluorescente. Quando a amplificação começa, a DNA polimerase corta a sonda, e a fluorescência é liberada. A fluorescência é liberada a cada ciclo, gerando um sinal fluorescente específico da seqüência.

28 Moléculas individuais de ácidos nucléicos (fita simples) apresentam a capacidade de formar moléculas de fita dupla (hibridização) necessidade de alta complementaridade entre as bases para que isso aconteça; Sensibilidade menor que os métodos de amplificação gênica Hibridização Utilizada para confirmação

29 Hibridização

30 Sondas são marcadas direta ou indiretamente com enzimas, radioisótopos ou substratos quimioluminescentes / antigênicos, possibilitando a hibridização e detecção –Fase líquida: captura híbrida –Fase sólida: Southern e Northern blot, Dot Blot e Colony Blot Hibridização

31 Fase Líquida: captura híbrida

32 Enzimas de Restrição: enzimas isoladas de procariotos que reconhecem seqüências específicas no DNA dupla fita. Fase sólida: Ácidos nucléicos digeridos com enzimas de restrição e imobilizados em um suporte sólido

33 Fase sólida: Ácidos nucléicos imobilizados em um suporte sólido Southern e Northern Blot

34 Dot Blot : ácido nucléico diretamente imobilizado em membranas, vácuo

35 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição) – Tipagem exemplo: variações dentro do gene rRNA, que é conservado –Comparação entre o número e o tamanho dos fragmentos; –Variações no tamanho dos fragmentos gerados por distintas amostras de DNA após clivagem enzimas de restrição; –Padrões de bandas diferenciados indicam organismos distintos geneticamente (mesma espécie ou não); Análise de seqüências

36 RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA polimórfico randomicamente amplificado)- DNA fingerprinting –PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa estringência (especificidade no produto de DNA a ser amplificado) –Não é necessário um conhecimento prévio do genoma –Uniformidade no padrão de bandas para espécies relacionadas Análise de seqüências

37 DNA Desnaturação a 95 o C DNA

38 Extensão a 72ºC

39 400bp 310bp 260bp 75bp Fragmentos de RAPD

40 Visualização de Fragmentos de RAPD

41 Diferentes técnicas : quando se conhece ou não o genoma do organismo estudado Processamento das amostras é de extrema importância ácidos nucléicos de boa qualidade, pureza e, principalmente, com mínimo de inibidores Utilização de técnicas moleculares na avaliação e detecção da diversidade microbiana

42 Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos

43 Análise de contaminação bacteriana e viral em moluscos: O LVA vem trabalhando na avaliação da contaminação em moluscos desde aproximadamente 10 anos; Importância devido o grande destaque de Florianópolis e região na Maricultura Moluscos: animais filtradores concentram patógenos Salmonella spp. Vírus: RNA Hepatite A, Rotavírus, Norovírus, Poliovirus DNA Adenovírus, Poliomavírus,

44 Necessidade de diminuição de inibidores presentes na carne de ostras e enriquecimento da amostra em meio de cultivo (viabilidade e aumento do número de células)

45 Análise de contaminação viral em amostras de águas:

46 Método de filtração e concentração (Katayama et al., 2002) Centriprep - Millipore

47

48 Alto custo da infra-estrutura do laboratório e reagentes; Diferenciação entre células viáveis e não viáveis; depende da técnica e do organismo a ser estudado Dificuldade em pesquisar quando o genoma do microrganismo não é conhecido. Problemas...

49 : MAPA L-2/CNPq: IMPLEMENTAÇÃO DE TÉCNICAS DE DEPURAÇÃO DE OSTRAS DE CULTIVO QUE VISEM GARANTIR A QUALIDADE E INOCUIDADE DO PRODUTO : Ed. Universal/CNPq 2007 : VALIDAÇÃO E APLICAÇÃO DE MÉTODOS MOLECULARES PARA QUANTIFICAÇÃO DE VÍRUS HUMANOS DE INTERESSE EM SAÚDE PÚBLICA E MEIO AMBIENTE: Rotavírus, adenovírus e vírus da hepatite A como modelos de contaminação de águas ambientais : Ed. FINEP/SEBRAE: Produção de ostras triplóides da espécie Crassostrea gigas.. 30/11/2008 a 30/10/2009 FAPESC: Produção de sementes de ostras triplóides (3n) para a maricultura catarinense : AECID: Agencia Espanola de Cooperación Internacional para el Desarollo (INTERNATIONAL COLABORATION BETWEEN UFSC AND BARCELONA UNIVERSITY FOR HUMAN EXCHANGE) : Desenvolvimento de métodos para a detecção e quantificação de vírus em moluscos. PROJETOS EM ANDAMENTO


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