Características do DNA

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1 Características do DNA
Formado por fita dupla complementar; 5´ 3´ 3´ 5´

2 Características do DNA
Capacidade de autoreduplicação; Formado por bases nitrogenadas (A, C, G e T);

3 Introdução ao PCR Reação da Polimerase em Cadeia
Outubro de 1985 (idéia em 1983) Publicado na American Society of Human Genetics criado por Kary B. Mullis

4 Características do PCR
Amplificação de Seqüências de DNA ou RNA Processo Cíclico 15 a 40 ciclos realizado por mudança de temperatura

5 Produção de DNA por PCR Produção de 2 a 4 mg DNA em 1-3 hs
específico = amplifica sequência-alvo na presença de DNA genômico sensível = detecta inclusive 1 sequência de molde (DNA ou RNA) flexível = muitas variações da técnica básica de PCR

6 Requerimentos Básicos do PCR
1. Molde - DNA ou RNA 2. DNA polimerase 3. dNTPs 4. Iniciadores de Oligonucleotídeos (Primers)

7 Função dos Iniciadores Primers
fornecer grupo 3’ OH para iniciar a síntese de DNA definir os limites do segmento de DNA-alvo a ser amplificado estabelecer especificidade

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9 Oligos Iniciadores Primers
sintetizados quimicamente tipicamente entre 15 a 25 bases define limites de alvo a amplificar prévio conhecimento da sequência alvo primer de seqüências aleatórias

10 Ciclos de Temperatura no PCR
Anelamento do Primer Tm Desnaturação Extensão 94oC do Primer 72oC

11 Desnaturação do DNA 94 a 100oC
desnaturar inicialmente o DNA alvo desnaturar produtos de ciclos prévios duração de 30 s a 1 min

12 Anelamento do Primer 40 a 70oC
temperatura de “hibridização” otimização da temperatura para cada par de primer composição = %G+C determina especificidade do produto amplificado tipicamente 30 s a 2 min

13 Extensão do Primer 72oC Taq polimerase
faixa de atividade: 20oC a 85oC atividade varia 100x nessa faixa Tempo de extensão varia de acordo com tamanho do produto desejado

14 Exponencialidade do PCR
Caso ideal: N = No 2n N = número de moléculas amplificadas No = número inicial de moléculas n = número de ciclos de amplificação

15 Amplificação Geométrica
Ciclo Número Fita Duplas produzidas