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PCR - consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

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Apresentação em tema: "PCR - consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA."— Transcrição da apresentação:

1 PCR - consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

2 Técnica inventada em 1985 por Kary B. Mullis A técnica já existia, entretanto, a DNA polimerase utilizada ( E. coli ) era destruída durante os ciclos de aquecimento e era necessário adição consecutiva a cada novo ciclo Foi o primeiro a sugerir a utilização de uma DNA Polimerase termoestável

3 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a descoberta de uma nova espécie de bactéria – Thermus aquaticus – sobrevive na água a temperatura média de 75ºC

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6 Polimerização: 5 3 Polimerização: 5 3 Todas as DNA polimerases requerem: Primer de oligonucleotídeo Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs) Cátion divalente -usualmente Mg2+ DNA molde

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8 PCR requer 7 componentes essenciais: DNA polimerase termoestável Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA ( primers) Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)Cátion divalente: toda DNA polimeraseRequer cátion divalente, usualmente Mg2+ Tampão para manter o pHCátions monovalentes, usualmente K + (KCl)DNA molde

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10 A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers). Oligonucleotídeos com 17 mers são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal como o genoma humano. O pareamento dos primers com a seqüência alvo na template se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrogênio, obedecendo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick: A T C G A T C G

11 Desnaturação do DNA molde (template) por aquecimento Pareamento dos primers à seqüência alvo fita simples Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável

12 1. Desnaturação: 94ºC – 96ºC Separa a dupla fita do template em duas fitas simples 2. Pareamento: 37ºC – 65ºC Primers ligam-se em locais específicos do DNA molde 3. Extensão: 72ºC DNA polimerase usa os dNTPs adicionando-os a nova fita de acordo com a regra de pareamento – polimerização.

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14 Primers: A concentração ótima de primer é entre 0,1 e 0,5 mM Ambos os membros do par devem ser usados na mesma concentração. Excesso de primers induz aparecimento de produtos inespecíficos e formação de dímeros de primers.

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