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FABIANA SEIXAS BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA.

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Apresentação em tema: "FABIANA SEIXAS BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA."— Transcrição da apresentação:

1 FABIANA SEIXAS BIBLIOTECAS DE DNA ou BANCOS DE DNA

2 TIPOS DE VETORES

3 Plasmídios são moléculas de DNA circular, fita dupla, extracromossômico, que ocorrem naturalmente em bactérias e algumas leveduras – pUC18 – pBR322 – pUP310 Ob.: Utilizados para clonar fragmentos de até 9kb VETORES PLASMIDIAIS

4 - Vírus que infectam bactérias; - DNA ou RNA; - Capsídeo - Biologia do fago - Utilizados para clonar fragmentos de 9kb a 25 kb BACTERIÓFAGO

5 -São híbridos entre plasmídios e bacteriófagos; - Utilizados para clonar fragmentos de 25 a 35 kb; COSMÍDEOS

6 DNA RECOMBINANTE

7 Bibliotecas de DNA DNA Genômico cDNA

8 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO É uma coleção de clones que representam a totalidade do genoma de um determinado organismo Consiste de todas as moléculas de DNA recombinantes que foram geradas pela ligação do DNA do organismo a um vetor (plasmideo, bacteriófago ou cosmídeo) Servem para isolar DNA específicos de um organismo

9 São usadas principalmente para procariotos Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de regiões reguladoras Independe do tipo de célula utilizada para a obtenção do DNA CARACTERÍSTICAS BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

10 - Representa todo o genoma de um organismo

11 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Fagos

12 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

13 BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO - Aplicações

14 BIBLIOTECAS DE cDNA É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA. É o conjunto de clones das seqüências codificadoras que estão sendo expressas pela célula naquele momento, obtido através da clonagem de moléculas cópias do mRNA. É usada principalmente para células eucarióticas. É usada principalmente para células eucarióticas. Varia de acordo com o tecido utilizado. Varia de acordo com o tecido utilizado. BIBLIOTECAS DE cDNA

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16 SINTESE DE cDNA Purificação do RNA Hibridização com poly(dT) Copia do DNA com RT Degradação do RNA Síntese de uma fita complementar

17 BIBLIOTECAS DE cDNA

18 Clonagem de cDNA em fago Clonagem de cDNA em fago BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

19 Etapas na construção de uma Biblioteca genômica e de cDNA

20 Biblioteca genômica: - Representam uma amostra aleatória de todas as seqüências de DNA de um organismo Biblioteca de cDNA - Contém moléculas que foram transcritas em mRNA - Produção de grande quantidade de mRNA por células especializadas - Varia de acordo com tipo e estado fisiológico da célula - mRNA é processado DIFERENÇAS BIBLIOTECAS

21 Seqüenciamento de todos os insertos usando iniciadores do vetor Screening Projetos genoma / transcriptoma Utilização de bibliotecas BIBLIOTECAS DE DNA GENÔMICO

22 TRIAGEM DE UMA BIBLIOTECA Detecção do produto do gene pela utilização de anticorposDetecção do produto do gene pela utilização de anticorpos Detecção do DNA através da técnica de hibridizaçãoDetecção do DNA através da técnica de hibridização

23 Triagem de uma biblioteca Conhecer parte da seqüência do gene Sequência completa do gene Sonda de DNA Utilizar sonda de oligonucleotídeos derivado de uma proteína Codon degenerado Conhecer cerca de 6aa contíguos Anticorpos

24 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos Triagem de uma biblioteca

25 1- Detecção do produto do gene pelo uso de anticorpos Triagem de uma biblioteca

26 É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens diferentes É a formação de molécula fita dupla, através do pareamento de duas fitas de DNA ou uma de DNA e outra de RNA complementares, mas de origens diferentes Hibridização Renaturação 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização HIBRIDIZAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS Triagem de uma biblioteca

27 Marcação da Sonda de DNA Radioativa: 32 P – nick traslationRadioativa: 32 P – nick traslation Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaEnzimática: peroxidase, fosfatase alcalina SONDA de DNA - Seqüência de DNA Marcada Triagem de uma biblioteca

28 Marcação da Sonda de DNA Radioativa: 32 P – nick traslation Atividade Exonucleasica da DNA polimerase DNA polimerase preenche com nucleotídeos marcados Cortar o DNA fita dupla DNA fita simples Moléculas de DNA radioativas Sondas Triagem de uma biblioteca

29 Marcação da Sonda de DNA Enzimática: peroxidase, fosfatase alcalinaEnzimática: peroxidase, fosfatase alcalina Desnaturação DNA DNA fita simples Ligação Fraca (DNA+ Peroxidase) Sondas Covalentemente marcada com a enzima + peroxidase complexada com polimero positivo + glutaraldeído Triagem de uma biblioteca

30 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização Placas com Colônias contendo os plasmídeos Lise das Bactérias – Desnaturação do DNA Sonda Filme de Raio - X Triagem de uma biblioteca

31 2- Detecção do DNA através da técnica de hibridização Triagem de uma biblioteca

32 Caracterização da seqüência encontrada Seqüenciamento de DNA Seqüenciamento de DNA PCR PCR Expressão da sequência codificadora Expressão da sequência codificadora Triagem de uma biblioteca

33 Southern Blot - DNA Northern Blot - RNA Western Blot - Proteína Técnicas de Hibridização

34 Sonda: seqüência de DNA marcada Transferência de DNA do gel para a membrana Southern Blot – RNA

35 4. Geração de uma sonda marcada pGEM-T dATP dGTP dTTP dCTP 1. Extração do DNA 2. Eletroforese do RNA 3. Transferencia para a menbrana 5. Hibridização 6. Visualização Northern Blot – RNA

36 Trabalho Prático 1


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