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UBAIII Biologia Molecular 1º Ano 2012/2013. 17Jan/2013MJC-T14 Sumário: D. Técnicas de Biologia Molecular em Ciências da Saúde Capítulo XIV. Técnicas básicas.

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1 UBAIII Biologia Molecular 1º Ano 2012/2013

2 17Jan/2013MJC-T14 Sumário: D. Técnicas de Biologia Molecular em Ciências da Saúde Capítulo XIV. Técnicas básicas para o estudo de ácidos nucleicos. Isolamento e purificação de ácidos nucleicos Separação de ácidos nucleicos Visualização Tecnologia de DNA recombinante Capítulo XV. Biotecnologia Aplicada às Ciências da Saúde Microarrays princípios da técnica O que são microarrays? Vários tipos de sondas (DNA, cDNA, RNA, proteínas) Hibridização Leitura Aplicações dos microarrays em medicina: Expressão diferencial de genes Biomarcadores Marcadores de alvos clinicos, funções biológicas semelhantes, ligação entre genes Detecção de agentes patogénicos 2

3 17Jan/20133MJC-T14

4 Purificação dos ácidos nucleicos Homogeneização das células Lise nuclear com solução tamponada de NaCl com SDS. Precipitação proteica com fenol/clorofórmio Centrifugação Adição de etanol precipitação dos ácidos nucleicos 17Jan/2013MJC-T144 Separação das proteínas e RNA

5 Obtido o DNA em filamentos brancos É novamente dissolvido em solução aquosa Tratado com RNAse Pode ser também obtido RNA se o tratamento for feito com DNAse RNAse ou DNAse removidas com protease Lavagem com fenol (para remover.....) Precipitação com etanol. 17Jan/2013MJC-T145

6 Mais recentemente.... Colunas para isolamento de DNA Membranas e matrizes que ligam DNA especificamente Lisado de células + matriz lavado e centrifugado Eluição da matriz. 17Jan/2013MJC-T146

7 17Jan/2013MJC-T147

8 Separação do DNA Tamanho Composição de bases Topologia Sequência de nucleótidos 17Jan/2013MJC-T148 Electroforese Ultracentrifugação

9 Electroforese 17Jan/2013MJC-T149

10 Ultracentrifugação – Velocidade de sedimentação Unidades S influência da massa. 17Jan/201310MJC-T14

11 Ultracentrifugação – Centrifugação equilibrada Separa também moléculas com radioisótopos. 17Jan/201311MJC-T14

12 Hibridização de ácidos nucleicos 17Jan/201312MJC-T14

13 Hibridização de ácidos nucleicos 17Jan/201313MJC-T14

14 Tecnologia do DNA recombinante – enzimas de restrição 17Jan/201314MJC-T14

15 Formação do DNA recombinante 17Jan/201315MJC-T14

16 17Jan/201316MJC-T14

17 17Jan/201317MJC-T14 Clonagem do DNA em bactérias

18 17Jan/201318MJC-T14 Clonagem do DNA em bactérias

19 17Jan/201319MJC-T14 Clonagem do DNA em bactérias

20 17Jan/201320MJC-T14 Clonagem do DNA em bactérias

21 17Jan/201321MJC-T14 Clonagem do DNA em bactérias-screening

22 17Jan/201322MJC-T14 Clonagem do DNA em bactérias-screening

23 Separação dos Plasmideos por centrifugação 17Jan/201323MJC-T14 Corte com as enzimas de restrição iniciais

24 Clonagem do DNA em vírus 17Jan/2013MJC-T1424

25 Clonagem do DNA em vírus 17Jan/2013MJC-T1425

26 Clonagem do DNA em vírus 17Jan/2013MJC-T1426

27 O que significa Microarray? 17Jan/2013MJC-T1427

28 O que é posto nas lâminas? Sondas (?) Moléculas com capacidade de se ligar a outras hibridizar DNA cu RNA Proteínas Qual a origem deste material? Bibliotecas de DNA Genómicas cDNA DNA RNA Proteínas 17Jan/2013MJC-T1428

29 Escolha das sondas a utilizar Comprimento bases Especificidade Impressão da lâmina Orientação do fragmento Hibridização pretendida As sondas hibridizam com a amostra que é marcada com fluorescência. Assim um sinal fluorescente no resultado o que significa? 17Jan/2013MJC-T1429

30 Condições de hibridização Quantidade e qualidade da amostra Replicação com [amostra] Solução de hibridização e lavagem Normalmente é definida pelo fabricante do chip Tempo de incubação Gerido em função de estudos piloto e também definido pelo fabricante Temperatura de incubação Depende por vezes da sequência (conteudo GC) Porquê? 17Jan/2013MJC-T1430

31 Leitura do chip Depende de ter sido utilizado 1 ou 2 corantes diferentes 17Jan/2013MJC-T1431

32 Expressão diferencial de genes 17Jan/2013MJC-T1432

33 Expressão diferencial de genes 17Jan/2013MJC-T1433

34 Expressão diferencial de genes 17Jan/2013MJC-T1434

35 Recursos utilizados Capítulo 18 Karp secções e secção Capítulo 12 Karp secção html (Microarray de DNA de leveduras). html 17Jan/201335MJC-T14


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