Extração de DNA de Plantas.

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1 Extração de DNA de Plantas

2 Purificação de Ácidos Nucléicos
- Necessário separá-los efetivamente dos outros constituintes celulares. - Fundamental manter a integridade das moléculas, que devem permanecer inalteradas durante o procedimento de extração, pois as informações contidas no DNA/RNA dependem da sequência. - Maioria dos métodos de extração não afetam a sequência diretamente, mas alguns protocolos resultam na quebra dos polímeros de DNA ou RNA, causando a perda de informações.

3 Purificação de Ácidos Nucléicos
- A quebra dos polímeros afeta mais DNA do que RNA, mas a hidrólise enzimática (nucleases) afeta mais os RNAs do que DNA. - Existem vários métodos descritos na literatura, e a escolha depende do balanço entre a praticidade, qualidade e a finalidade de uso do ácido nucléico.

4 Principais passos: 1. Ruptura dos tecidos através da moagem de tecidos congelados na presença de nitrogênio líquido ou gelo seco. 2. Liberação de componentes celulares num tampão de moagem por lise das membranas com detergentes (SDS, sodium dodecil sufato; ou CTAB, cetiltrimetilamonio brometo). O tampão de extração deve possuir pH entre 8,0 e 9,0, desfavorável à ação de nucleases.

5 Principais passos: 3. Inativação de nucleases por esses detergentes e agentes quelantes (EDTA, ethileno diamono tetraacetato). Este agente quelante imobiliza cátions de Mg, que são cofatores para várias endonucleases. 4. A emulsificação da mistura de tampão e tecido com fenol ou clorofórmio leva a desnaturação das proteínas. Na extração de DNA de plantas, utiliza-se o PVP (polivinilpirrolidona) por possuir efeito antioxidante, e é adicionado para evitar a oxidação de polifenóis. O agente redutor b-mercaptoetanol inibe a atividade de peroxidases e polifenoloxidases.

6 Principais passos: 5. Remoção dos resíduos celulares e precipitação das proteínas por centrifugação. 6. A desproteinização é obtida através de um tratamento com fenol ou clorofórmio, pois esses solventes orgânicos desnaturam as proteínas e enzimas, e são separadas após centrifugação, permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior) contendo as ácidos nucléicos e a fase orgânica (inferior). Alguns protocolos incorporam proteases (proteinase K) para facilitar a separação do DNA das proteínas da cromatina.

7 Principais passos: 7. Recuperação dos ácidos nucléicos totais por precipitação em álcool (etanol ou isopropanol). 8. Eliminação do RNA por digestão com RNAse, ou separação de RNA e DNA por solubilidade diferencial em sais. Sob condições de alta concentração de sais (Ex. 7,5 M de Acetato de Sódio), DNA e os RNA pequenos (principalmente tRNA) permanecem em solução, enquanto que RNA (> que 60 bases) precipita.

8 Contaminação com Polissacarídeos
- Contaminantes (polifenóis, polissacarídeos etc.) interferem na atividade de enzimas de restrição e no PCR - A contaminação por polissacarídeos consiste na principal contaminação afetando a pureza do DNA extraído de plantas. Esses carbohidratos podem inibir a atividade de várias enzimas usadas em manipulações biológicas de DNA, tais como ligases, polimerases, e enzimas de restrição.

9 Contaminação com Polissacarídeos
- A maioria dos métodos de extração empregados não separam eficientemente o DNA dos polissacarídeos, provavelmente devido a similaridade estrutural entre esses dois tipos de polímeros. - A contaminação por polissacarídeos depende da espécie, tecido, condições fisiológicas da planta amostrada, etc. Certas espécies "produzem" um DNA muito contaminado por polissacarídeo, tomando difícil a ressuspensão do pellet.