Obtenção do material: Vírus Bactérias; fungos

Apresentação em tema: "Obtenção do material: Vírus Bactérias; fungos"— Transcrição da apresentação:

1 Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos
Obtenção do material: Vírus Bactérias; fungos Célula vegetal / célula animal

2 Extração de ácidos nucléicos
Requerimento essencial: quantidade (rendimento) pureza integridade Etapas na obtenção de ácidos nucléicos: Lise física ou bioquímica das paredes celulares e membranas Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares Precipitação

3 Extração de ácidos nucléicos
1. Rompendo membranas celulares Lise das células  liberação dos componentes citoplasmáticos e/ou nucleares Estratégia: de acordo com o tipo de célula envolvida: (deve ser o mais “gentil” possível) - bactérias (parede glicoproteica)  tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede  enfraquecimento  rompimento em solução hipotônica); outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação

4 Extração de ácidos nucléicos
Células de plantas ou animais presentes em tecidos: Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual  célula individual  lise: digestão enzimática / homogeneização Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.

5 Extração de ácidos nucléicos
Células sem cobertura externa ou em solução: Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente – SDS (SODIUM DODECYL SULFATE) – dodecil sulfato de sódio  substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas solução de lise: NH4Cl / NH4HCO3

6 2. Desnaturando proteínas celulares:
Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas: - DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos. Fragmentos de membrana lipídica Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses  interferem no rendimento dos ácidos nucléicos Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: Extração em baixas temperaturas Incubação dos lisados com reagentes desnaturan- tes de proteínas Agentes que retardam atividade das nucleases:

7 Extração de ácidos nucléicos
Agentes que retardam atividade das nucleases: tampões de extração com agentes quelantes (EDTA – ácido etileno diaminotetracético) Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico  desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato )

8 Extração de ácidos nucléicos
3. Separando DNA / RNA / Proteínas Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas (emprega solubilidade diferencial de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos no fenol) Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos) interface: proteínas camada do fenol

9 Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:
Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico) 3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA) interface: proteínas camada do fenol Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol pH neutro ou básico pH

10 Após centrifugação do lisado / mistura com fenol:
Extração de RNA (fenol com pH ácido) 3 fases: aquosa (RNA) interface: proteínas camada do fenol (DNA) Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol pH ácido pH

11 Extração de ácidos nucléicos
4. Precipitação e lavagem com álcool DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC  -20º C DNA precipitado

12 Extração de ácidos nucléicos
4. Precipitação e lavagem com álcool RNA: Ressuspender RNA em água estéril (DEPC) – incubar à 55 – 65ºC por 10 minutos (inativar RNAse) – armazenar `a -80ºC RNA precipitado

13 Extração de ácidos nucléicos com fenol
RNA DNA Camada aquosa (RNA) Interface (proteínas) Camada de fenol (DNA) Fenol pH ácido Fenol pH neutro/alc. DNA pptado RNA pptado

14 Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total

15 Extração de ácidos nucléicos

16 Extração de ácidos nucléicos

17 Gel de agarose 1% com 3 ml de DNA genômico
M - Marcador 1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico

18 Extração de ácidos nucléicos
Soluções utilizadas tampão de extração solução de lise solução desnaturante de proteínas fenol clorofórmio Etanol Proteinase K

19 Extração de ácidos nucleicos Função dos reagentes
Tampão: proporciona um pH ideal para manutenção da integridade das moléculas de ácidos nucléicos; inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE - pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino tetracético). Detergentes: substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídios de membrana; SDS = sodium dodecyl sulfate. Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento de DNA/RNA de amostras biológicas.

20 Extração de ácidos nucléicos Função dos reagentes
Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a eficiência da extração de ácidos nucléicos. Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA) DEPC – dietil pirocarbonato). Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de ácidos nucléicos provocando a agregação das moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos de fenol e clorofórmio). Proteinase K – a contaminação com proteínas pode ser removida pela digestão com proteinase K