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Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos Obtenção do material: Vírus Bactérias; fungos Célula vegetal / célula.

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1 Isolamento de ácidos nucléicos de células e tecidos Extração de ácidos nucléicos Obtenção do material: Vírus Bactérias; fungos Célula vegetal / célula animal

2 Extração de ácidos nucléicos Requerimento essencial: quantidade (rendimento) pureza integridade Etapas na obtenção de ácidos nucléicos: Lise física ou bioquímica das paredes celulares e membranas Purificação dos ácidos nucléicos: desnaturação / inativação de proteínas celulares Precipitação

3 Extração de ácidos nucléicos 1. Rompendo membranas celulares Lise das células liberação dos componentes citoplasmáticos e/ou nucleares Estratégia: de acordo com o tipo de célula envolvida: (deve ser o mais gentil possível) - bactérias (parede glicoproteica) tratamento inicial com lisozimas (orifícios na parede enfraquecimento rompimento em solução hipotônica); outras soluções alternativas: temperatura elevada; sonificação

4 Extração de ácidos nucléicos Células de plantas ou animais presentes em tecidos: Pré tratamentos adicionais para romper a matriz tecidual célula individual lise: digestão enzimática / homogeneização Célula vegetal – parede celular: tratamento mecânico para promover lise.

5 Extração de ácidos nucléicos Células sem cobertura externa ou em solução: Sem tratamentos agressivos – tratamento com detergente – SDS (SODIUM DODECYL SULFATE) – dodecil sulfato de sódio substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos e dissolvendo proteínas de membranas solução de lise: NH 4 Cl / NH 4 HCO 3

6 2. Desnaturando proteínas celulares: Lisados celulares contêm mistura complexa de macromoléculas: - DNA / RNA; proteínas, lipídeos, carboidratos. -Fragmentos de membrana lipídica -Proteínas intracelulares: enzimas nucleases degradativas – DNAses / RNAses interferem no rendimento dos ácidos nucléicos Melhora na recuperação dos ácidos nucléicos: -Extração em baixas temperaturas -Incubação dos lisados com reagentes desnaturan- tes de proteínas -Agentes que retardam atividade das nucleases:

7 Extração de ácidos nucléicos Agentes que retardam atividade das nucleases: - tampões de extração com agentes quelantes (EDTA – ácido etileno diaminotetracético) -Solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico desnaturam nucleases e coagulam proteínas durante a extração -RNA- inibir Rnases (proteinase K; DEPC – dietil pirocarbonato )

8 Extração de ácidos nucléicos 3. Separando DNA / RNA / Proteínas Extração por solventes - precipitação e/ou centrifugação Extração com fenol – solvente orgânico; desnatura proteínas; permite isolamento de DNA e proteínas (emprega solubilidade diferencial de proteínas, lipídios e ácidos nucleicos no fenol) Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: 3 fases: aquosa (ácidos nucleicos) interface: proteínas camada do fenol

9 Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: Extração de DNA (fenol com pH neutro ou básico) 3 fases: aquosa (ácidos nucléicos: DNA e RNA) interface: proteínas camada do fenol Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol pHpH pH neutro ou básico

10 Após centrifugação do lisado / mistura com fenol: Extração de RNA (fenol com pH ácido) 3 fases: aquosa (RNA) interface: proteínas camada do fenol (DNA) Camada aquosa Camada de proteínas Camada do fenol pHpH pH ácido

11 Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool DNA: Ressuspender DNA em TE pH 8,0 – (Tris-HCl / EDTA), até completa dissolução – Armazenar a 4ºC -20º C DNA precipitado

12 Extração de ácidos nucléicos 4. Precipitação e lavagem com álcool RNA: Ressuspender RNA em água estéril (DEPC) – incubar à 55 – 65ºC por 10 minutos (inativar RNAse) – armazenar `a -80ºC RNA precipitado

13 Extração de ácidos nucléicos com fenol DNA RNA Camada aquosa (RNA) Interface (proteínas) Camada de fenol (DNA) Fenol pH neutro/alc. Fenol pH ácido DNA pptadoRNA pptado

14 Extração de ácidos nucléicos a partir de sangue total

15 Extração de ácidos nucléicos

16

17 Gel de agarose 1% com 3 l de DNA genômico M M - Marcador 1, 2 e 3 - amostras de DNA genômico

18 Extração de ácidos nucléicos Soluções utilizadas tampão de extração solução de lise solução desnaturante de proteínas fenol clorofórmio Etanol Proteinase K

19 Extração de ácidos nucleicos Função dos reagentes Tampão: proporciona um pH ideal para manutenção da integridade das moléculas de ácidos nucléicos; inibem atividade de desoxirribonuclease; ex.: TE - pH 8,0 (Tris-HCl / EDTA – ácido etilenodiamino tetracético). Detergentes: substâncias tensoativas que agem dissociando as proteínas dos ácidos nucléicos e dissolvendo os lipídios de membrana; SDS = sodium dodecyl sulfate. Fenol: desnatura proteínas, permitindo o isolamento de DNA/RNA de amostras biológicas.

20 Extração de ácidos nucléicos Função dos reagentes Clorofórmio: desnatura proteínas aumentando a eficiência da extração de ácidos nucléicos. Inibidores de nucleases: quelante de Mg++(EDTA) DEPC – dietil pirocarbonato). Etanol: induz alterações estruturais nas moléculas de ácidos nucléicos provocando a agregação das moléculas, seguida de precipitação (remove resíduos de fenol e clorofórmio). Proteinase K – a contaminação com proteínas pode ser removida pela digestão com proteinase K


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